下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

　　1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

　　2. 在打开之前，平衡生物素至室温。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10 mg/ml 蛋白来说超过12倍分子数，对于2 mg/ml 蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中

　　3. 室温30分钟，或冰上放置2小时。

　　4. 用30 ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5 ml 或1 ml 于单独的管中。

　　5. 以280 nm 的吸收值测定蛋白含量。

　　6. 生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

　　HABA法检测生物素标记效果

　　试剂配制：

　　1. PBS（100 mM 磷酸盐，150 mM Nacl

　　pH7.2）

　　2. HABA/亲和素溶液：10 mg 亲和素、600 ul10 mM

　　HABA于19.4 ml 的PBS中，该溶液的A500大约在0.9~1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

　　比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：

　　1. 吸取900 ul

　　HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

　　2. 测定该溶液在500 nm 处的吸收值并记录为“A500

　　HABA/Avidin”。

　　3. 吸取100 ul 生物素标记的蛋白于杯中并测定500 nm 的吸光度值，记为A500

　　HABA/Avidin/Biotin （数值必须恒定15s 以上）如果A500

　　HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

　　注：计算结果时必须考虑稀释度。

　　4. 计算Biotin/Protein摩尔比

　　①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量

　　②B=500nm处的吸光度变化

　　△A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin

　　③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程）

　　④Biotin/Protein摩尔比=C•10•稀释倍数/