本期主题为“水稻基因组 DNA的 Southern杂交与非放射性ECL直接核酸标记及检测”，主要是满足初学者对Southern杂交的了解。 Southern杂交的新手们不妨参考下。

【实验目的】

通过本实验学习和掌握Southern转膜、辣根过氧化物酶直接标记探针、Southern杂交及增强化学发光(ECL)检测分子 杂交结果的过程。

【实验原理】

Southern杂交是一项在复杂的背景基因中识别特异性DNA序列的重要技术之一，它是Southern于1975年首创的杂交方法。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链DNA在一定的条件下可按碱基互补原则(A=T,C=G)形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及标记的探针 。此杂交过程是高度特异性的。

ECL直接核酸标记及检测系统用辣根过氧化物酶(HRP)直接标记探针。该法用带正电荷的核酸标记试剂(经修饰成为带正电荷的HRP聚合体：HRP—对苯醌—聚乙烯亚胺复合物)与变性过的、带负电荷的单链核酸探针松散连接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化学交联作用下与带负电荷的单链DNA共价结合，从而标记DNA。标记的探针DNA与膜上的单链DNA杂交形成双链DNA，探针上的HRP在H2O2存在下，催化H2O2还原，同时使鲁米诺氧化并伴随蓝光产生，在增强剂的作用下使产生的光加强，从而可在X光片上检测。

首先将经限制性内切酶酶解的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离以及在凝胶上经NaOH处理使之变性，然后将尼龙膜(Hybond-N+)放在凝胶上，使之按原有顺序将条带转移至膜上并固定起来，这是Southern转膜过程。

Southern膜杂交是将吸附并固定在Hybond-N+尼龙膜上的DNA片段与一个标记的探针杂交，最后经过显影从X光片上显现出杂交分子的区带。

本实验中，经琼脂糖凝胶电泳分离的水稻基因组DNA酶切产物，通过Southern转移，将其吸印在Hybond-N+尼龙膜上，通过辣根过氧化物酶直接标记探针，与膜上的水稻DNA进行杂交，再用增强的化学发光方法得到分子杂交结果。

本实验所用的探针来源于水稻和大麦，具有抗病基因NBS-LRR结构特点的DNA探针，因此水稻DNA和探针之间有较好的同源性，可得到杂交带，可满足初学者对Southern杂交方法进行训练。

【仪器、材料与试剂】

(一) 仪器

恒温水浴器 烤箱 台式高速离心机

琼脂糖凝胶电泳系统 高压灭菌锅 -70℃或-20℃冰箱

(二)材料

限制性内切酶 ECL试剂盒 氯化钠(NaCl)

柠檬酸钠 盐酸(HCl) 氢氧化钠(NaOH)

蔗糖 硼酸 溴酚蓝

十二烷基硫酸钠(SDS) 显影粉 定影粉

溴化乙锭(EB) 20μl, 100μl, 1000μl微量加样器及吸头，小指管

Whatman No.1滤纸及普通滤纸 10 cm×5 cm玻璃板 尼龙膜(Hybond-N+)

卫生纸(或吸水纸) 裁纸刀 杂交盒

500g重物 X光片夹及X光片 剪子、镊子、刀片、胶带

保鲜膜 一次性手套

(三)试剂

1. 20×SSC(1000 mL)：3 mol/LNaCl(175.32g);0.3 mol/L柠檬酸钠(88.26g)，用1 mol/LHCl调至pH7.0

2. 变性溶液(500mL)：1.5 mol/LNaCl(43.83g);0.5 mol/LNaOH(10g)

3. 中和溶液(500mL)：1.5 mol/L NaCl(43.83g);0.25 mol/L NaOH(5g)

4. 5×TBE(250 ml)：13.5g Tris，6.9 g硼酸，0.9g EDTA-Na2，用蒸馏水定容至250 ml

5. TE(10mL)：10 mmol/LTris-HCl;1 mmol/LEDTA pH8.0

6. 0.25 mol/LHCl(500 mL)

7. 6×溴酚蓝载样液(1mL)：0.25%溴酚蓝;40%蔗糖

8. EB染色液：0.5 μl/L 溴化乙锭

【实验步骤】

(一)基因组DNA的提取(略)

(二)样品的限制性酶切及酶切效果检查

1. 在1.5 ml 离心管中加入5 mg 基因组DNA进行限制性酶切;加入1/10终体积的10×反应缓冲液和50U限制酶(如Dra I)。加ddH2O至酶切反应终体积。将反应物按照厂商说明在适当温度温育(如37℃下反应过夜)。

2. 取10%或更少体积已酶解的温育混合物，用0.5×TBE缓冲液于0.8%琼脂糖胶上进行电泳，片段分开及染色后，可见DNA弥散带。部分酶解的样品DNA在胶的顶端可见一条未酶解的带，已酶解的DNA弥散带亮度较弱。根据不同道上弥散带亮度，调节DNA量以确保有等量的DNA进行电泳。

(三)Southern转移(以下操作要戴上一次性手套)

1. 将酶解的DNA样品小心加入0.8%琼脂糖胶的加样孔中。各取20ng 1Kb plus和Control DNA (HindIII酶切的λDNA)梯度标准参照物，分别与6×加样缓冲液混匀后加入第一与最后一个加样孔中。以25V电泳24~48 h。

2. 将琼脂糖胶浸入0.25 mol/L HCl溶液中10 min(至溴酚兰由蓝色变桔黄色)，使DNA脱嘌呤。

3. 将胶浸入变性液(0.5 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl)中变性30 min，使DNA双链变性成单链。

4. 将胶浸入中和液(0.25 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl)中平衡20 min。

5. 准备一个供DNA从胶上向尼龙膜转移的玻璃平台。将一张0.2um的Hybond-N+尼龙膜(英国Amersham公司生产)和一张滤纸切成与待转移胶相同大小，另将一张滤纸切成与胶相同宽度，长度较长足以达到盛转移液盒子的底部。

6. 将较长的滤纸在转移液(0.25 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl)中浸湿后置于平台上，两端浸入转移液中(使溶液不断地吸到滤纸上)。将胶置于滤纸上部，用玻璃棒仔细赶掉凝胶与滤纸间的气泡，用镊子将Hybond膜置于胶上并用玻璃棒赶掉Hybond膜与凝胶间的气泡，将剩下的滤纸在转移液中浸湿后置于膜上，再次赶尽气泡。放一叠卫生纸(与尼龙膜同样大小，约1000g)压在滤纸上部，再放相同尺寸的玻璃板，最后放一重物(约500g)在玻板上，让凝胶上的DNA转移12h或过夜。

7. 将尼龙膜与凝胶剥离，凝胶用EB染色后观察(胶上应无桔黄色荧光条带，说明DNA转移完全)。弃去胶，把尼龙膜浸在6×SSC溶液中，约5min后取出。

8. 将尼龙膜夹在4层普通滤纸中，置80℃烘箱中烤2 h，使已转移的DNA与膜交联。

(四)探针标记

DNA探针采用具有抗病基因NBS-LRR结构特点的探针(可通过PCR扩增制备)，用ECL系统(英国Amersham公司生产)进行标记。取所需标记的DNA探针于95℃变性5 min，冰浴5 min;然后加入与探针等体积的DNA标记试剂(带正电荷的辣根过氧化物酶聚合体)和化学交联剂戊二醛溶液;混匀并短暂离心后37℃保温10 min，放于冰上备用。

(五)Southern杂交

1. 将已烘烤过的膜放入杂交盒中，加入预热的含有0.5mol/L NaCl和5%封闭试剂的杂交液(英国Amersham公司生产)，使杂交液刚好没过尼龙膜，置于42℃预杂交1h(预杂交的目的是防止标记的探针与尼龙膜非特异性结合，从而使背景更清晰)。

2. 加入已标记的探针，混匀后于42℃杂交过夜(变性探针与膜上的特异性序列杂交)。

3. 弃杂交液，以55℃初洗液(0.4% SDS, 0.5×SSC)漂洗两次，每次10min，弃初洗液后，用2×SSC再漂洗两次，各5 min(洗膜目的是将尼龙膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从膜上洗去)。

4. 尼龙膜稍作吸印或晾干过多的漂洗液后，加等量的观察液1(H2O2)和观察液2(鲁米诺及增强剂)处理膜1分钟。

5. 移去过多的观察液，用保鲜膜包好尼龙膜，置于X光片夹中。

6. 在尼龙膜上压上X光片曝光1-2小时(在暗室中进行)。

7. 冲洗X光片(显影一水洗一定影)，分析杂交条带。所得数据用统计软件进行聚类分析。