一、原理： 利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可将其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA染色斑，说明有支原体污染。 二、试剂盒组分 ： 1．Hoechst 33258工作液 50ml 2．固定液 50ml 3．封固液 10ml 4．说明书 1份 三、未提供的设备及耗材 ： 1．荧光显微镜 2．6孔 细胞培养 板 3．22×22mm盖玻片 4．载玻片 四、操作步骤 ： （一）、贴壁细胞： 1、被检细胞接种在无菌的6孔 细胞培养 板中，接种密度为1～2×10 4 。同时，接种正常无支原体感染的同种细胞，作为阴性对照。 2、5天后，先吸去培养液，再加入1ml的固定液，静置20min， 3、吸去固定液，风干10min。 4、于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（注：Hoechst 33258工作液须覆盖全部被检细胞），37℃，15～20min（或室温静置20～30min）。 5、吸去Hoechst 33258工作液，直接风干。风干后加入一滴封固液，并以盖玻片覆盖。 6、用100-400x荧光显微镜观察。打开汞灯5分钟后，用UV激发光（330-380nm），吸收光（420-480nm）的滤光镜，观察细胞周围是否有兰色荧光小点或串珠状小点的荧光。 （二）、悬浮细胞： 1、收集需检测的细胞，1500rpm，5min。 2、对收集的细胞进行涂片于载玻片上，再加1ml的固定液，静置20min。 3、吸去固定液，风干10min。 4、于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（注：Hoechst 33258工作液须覆盖全部被检细胞），37℃，15～20min（或室温静置20～30min）。 5、吸去Hoechst 33258工作液，直接风干。风干后加入一滴封固液，并以盖玻片覆盖。 6、用100-400x荧光显微镜观察。打开汞灯5分钟后，用UV激发光（330-380nm），吸收光（420-480nm）的滤光镜，观察细胞周围是否有兰色荧光小点或串珠状小点的荧光。 五、结果判断 ：

六．保存条件 ： 4℃保存，有效期为2年，其中Hoechst工作液需要避光保存。 七．注意事项 ： 1．Hoechst工作液对人体有害，请注意防护。 2．固定液有刺激性气味，建议在通风橱进行固定。 3．支原体检测时，最好用不含抗生素的培养液培养2～3代，这样容易避免假阴性结果。 4．本 试剂 盒用于6孔板检测时，可以进行50次检测反应。 5．检测支原体污染，可以使用支原体高效Vero细胞，这样可以提高检测灵敏度，即将被检测样品接种于Vero细胞进行检测。