巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。

10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

上皮细胞培养

1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。

2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。

3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。

4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。

6、反复吹打，制成悬液。

7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。