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染色质小分子多肽的提取

关键词: 染色质 小分子 多肽来源: 互联网

染色质是细胞间期以散在形式存在的DNA、蛋白质和RNA相结合的复合物,其结构十分复杂,尤其是真核细胞的基因组,无论在数量上还是重复序列上都比原核细胞复杂。具有生命过程中的重要生理功能,如DNA的转录、均与染色质的结构和功能有关,在染色质上由于组蛋白的存在,其转录活性受到限制,只有转录活性的一部分,如去除组蛋白,其转录活性增高,染色质非组蛋白含有激活和抑制DNA转录的组分,对基因表达调控有重要作用。具有调控基因表达的染色质多肽,以从小牛胸腺和大鼠肝DNA中提出。并发现肿瘤组织中的含量较正常细胞减少,这是否与肿瘤细胞以及癌变过程中染色质多肽具有抑制和激活DNA转录的活性升高有关。     操作方法: (一)制备细胞核:( (二)提取染色质: 1.破细胞核:将纯核悬浮于4℃ 10mmol/L Tris-HCl pH7.6缓冲液中, 玻璃匀浆器 中匀浆,2h后于1,800g×15min,4℃,离心。弃上清,沉淀为粗染色质。     2.去 核蛋白 :沉淀悬浮于10ml冷的8mol/L脲素10.05mol/L PBS pH7.6溶液中,混匀,18,000g×15min,4℃,离心。弃上清,沉淀洗涤,离心后弃上清,保留沉淀。     3.脱脲盐:沉淀加入20ml冷的6.5%乙醇溶液,于1,500g×15min,4℃,离心。弃上清,沉淀按类似方法洗涤5次,以去除脲盐。这样可得到纯的染色质。   (三)多肽的梯度提取:     1.CP4.5多肽的提取:将染色质悬浮于0.005mol/L NH 4 Ac-HAc pH4.5 缓冲液 中,进行分次提取。每次提取时,用25ml NH 4 Ac/HAch 缓冲液 ,在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆5~6次,移入100ml锥形瓶中,在4℃冷室内电磁搅拌提取4h,1,500g×15min,4℃,离心。沉淀再提取,上清超虑,,收集含分子量<10,000的虑液进行UV扫描,重复5~6次,收集210nm吸收峰处虑液,并合并,冷冻真空干燥,得CP4.5样品。    2.CP9.5多肽的提取:将离心后的沉淀物及保留在虑膜上的物质合并,再用0.2mol/L  NH 4 Ac-HAc pH9.5缓冲液,按上述方法提取5~6次,得CP9.5。

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