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细胞及亚细胞组分的分离

关键词: 细胞 组分 分离来源: 互联网

 细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成,细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等,这些也称为亚细胞组分。对于细胞的结构及功能的研究,是细胞生物学的基本课题,其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分 。这种拆离的方法,使细胞中各种生物学过程彼此分开,互不干扰,便于确定一种复杂过程中的细节,从而深化我们对细胞整体功能的认识。用这种方法已经阐明了细胞中的许多重要反应,例如蛋白质的合成机制,最初发现细胞质粗提液使RNA翻译出蛋白质,将细胞质提取液分部分离,依次得到核糖体、tRNA和各种酶,用分别加入或不加入这些纯组分的方法,证实所有这些分子构成了蛋白质合成体系,以后用同样的体系阐明了遗传密码。     分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。差速离心适于分离密度和大小显著数量级差别的颗粒,用在分离细胞器是成功的,也是最常用的。对于精细部分的分离,则密度梯度离心效果更好,但制备介质梯度比较费时。     然而,针对不同的材料和分离目的不同,采用的分离介质及方法也有所不同。     操作方法: (一)  制备大鼠肝细胞匀浆  实验前大鼠空腹12h,取肝脏,迅速用生理盐水洗净血水,用滤纸吸干。称取组织2g, 剪碎,用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液(分数次添加),在0~4℃ 冰浴中用玻璃匀浆器制备肝匀浆,匀浆用双层尼龙织物过滤备用。 (二)  差速离心  先将9ml 0.34mol/L蔗糖溶液放入离心管,再沿管壁小心地加入9ml大鼠肝匀浆覆盖在 上层。 1. 分离细胞核(图) 2. 收集质膜 吸出细胞核沉淀中较疏松的上层,混悬于比重d 20 =1.16的蔗糖溶液中,沿管壁小心地 加入 离心管 ,使其覆盖在等量的比重d 20 =1.18的蔗糖溶液上。700g×10min离心,质膜最终集中在二层溶液的界面上。用尖头吸管小心地吸出质膜。 3. 细胞核纯化 将细胞核沉淀悬浮于5倍体积的0.34mol/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(AC) 2 溶液中,铺在4倍 于核悬液体积的0.88mol/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(AC) 2 溶液之上,1,500g×20min离心,弃上清,沉淀为纯化的细胞核。在RSB溶液中置4℃可保存数天。在0.01mmol/L EDTA -0.5mmol/L二硫苏糖醇( DTT )-5mmol/L MgCl 2 -50mmol/L Tris -HCl 缓冲液 (pH7.4)中,-20℃可保存数月。

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