一、LAK细胞的制备

试剂及材料

1. PHA

2. rhIL-2

3. 20%NCS-RPMI-1640培养液

操作方法

1. 常规分离PBM或将正常人外伤摘除的脾脏按常规方法制备成单个脾细胞悬液，用含20%NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106 /ml；

2. 将上述细胞加入24孔培养板孔中，同时加入60μg PHA，rhIL-2（终浓度为500U/ml），将细胞置37℃，5%CO2 条件下培养，2～3d换液一次。吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IL-2 20%NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。

二、TIL细胞的分离制备

试剂及材料

IL-2；RPMI-1640；Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、DNA酶；0.001%的透明质酸酶和DNA酶；80目和200目不锈钢网。

操作方法

1. 无菌切取肿瘤组织或肿瘤浸润的局部淋巴结，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中；

2. 将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10～20ml，同时加入0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4～6h；

3. 依次用80目和200目不锈钢网过滤；

4. 经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1500rmin离心5～10min；

5. 用含5%NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加入试管底层，其上缓慢加入75%的淋巴细胞分层液（用RPMI-1640配制）然后缓慢加入上述肿瘤细胞悬液3～5ml；

6. 经1500～1800r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞；

7. 用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5～10min。肿瘤细胞加入冻存液后液氮冻存备用。TIL则用含20%NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5×106 /ml；

8. 将上述细胞悬液接种于24孔培养板（1ml/孔），同时分别加入IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb 1μg/ml，置37℃，5%CO2 温箱培养3～4周，其间3～5d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液