一、目的

鉴定载体与目的基因是否已经成功连接成新的重组质粒。

二、原理

载体pUC18具有一个EcoRI 和HindIII的单酶切位点，含氨苄青霉素抗性基因。目的基因设计时分别在上、下游引物中加入了EcoRI 和HindIII单酶切位点，两者双酶切后，经连接酶连接，连接成功就形成了新的重组质粒。

在含50μg/ml Amp、40ml X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上，转化平皿长出白色菌落，说明目的基因已成功插入pUC18载体的Lacz基因中，重组质粒的转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

所以在含x-gal 和ITPG 的选择性培养基上长出的白色菌落，初步可以认为是重组转化子。为了防止假阳性的出现，需要通过重组子质粒的抽提，经EcoR I和HindIII 双酶切，凝胶电泳进一步鉴定，看是否酶切为原来的载体pUC18 质粒和PCR产物的分子量图谱。

如果是，则认为新构建的质粒已重组成功。当然最好的鉴定方法是通过测序来确认。

三、材料、试剂与器材

1.高速离心机、微量移液器、1.5ml EP管

2.Rapid Plasmid DNA Daily Mini－prep Kit：

3.DNA－prep Tube（Silica 膜）

4.2ml Microfuge Tube

5.Buffer S1（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl 维持pH 值、EDTA 抑制核酸酶、RNaseA1降解RNA）

6.Buffer S2（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性）

7.Buffer S3（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH 值）

8.BufferW1（乙酸钠洗脱蛋白质、糖类等大分子杂质）

四、实验步骤

（一）重组质粒制备

1.在5 毫升LB培养液中，用微量进样器加入5微升氨苄青霉素溶液。同时挑选一个在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上长出的白色单菌落，37℃援床培养过夜。

2.第二天分组用1.5ml EP 管收集细胞：将菌液10,000 rpm 离心1m，弃尽上清，重复一次，将管口倒置在纸巾上，轻轻敲击，使上清流出，管壁上不应有残留上清。

3.加入250μl BufferS1，涡旋，充分悬浮细菌沉淀。悬浮需充分，对光观察，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解。

4.加入250μl BufferS2，温和但充分地上下翻转4－6 次，此步骤不宜超过5m。避免剧烈混合，否则将导致基因组DNA 的污染。

5.加入400μl BufferS3，温和地上下翻转10－20 次，直至沉淀由疏松状态变为相对紧密，体积明显缩小为止，室温静置2m。12,000rpm 离心10m。避免剧烈混合，否则将导致基因组DNA 的污染。若离心后凝结块未沉淀沉淀到管底部，应再次翻转混合数次，12,000rpm离心3m。

6.将DNA－prep Tube置于2－ml Microfuge Tube中，将步骤4 中的上清加入DNA－prepTube 中，5,500rpm 离心1m。

7.弃滤液，将DNA－prep Tube置回到原2－ml Microfuge Tube中，加入500μl BufferW1，5,500rpm 离心1m。

8.弃滤液，将DNA－prep Tube置回到原2－ml Microfuge Tube中，加入500μl BufferW2，5,500rpm 离心1m。重复一次。

9.弃滤液，将DNA－prep Tube 置回到原2－ml Microfuge Tube 中，12,000rpm 离心2m，去除Silica膜上残余的试剂。

10.将DNA－prep Tube置于一洁净的1.5ml EP管中，在Silica 膜中央加60μl Eluent，室温静置2m，12,000rpm 离心1m，洗脱质粒DNA。

（二）重组质粒的酶切与检测

1.用微量进样器吸取下列试剂于一个已编好号码的Eppendorf 小管内（按次序一一加样）：

（1）灭菌重蒸水29微升

（2）中盐微缓冲夜4微升

（3）重组质粒3 微升

（4）EcoRI与HindIII酶各2微升反应液总体积为40 微升。

2.把塑料小管盖紧盖子，用于指轻轻弹底部溶液，混合均匀，置于高速离心机上离心

2 秒钟，使反应液甩入管底部。

3.将上述含有反应液的小管，置于一塑料泡沫上，放入37℃恒温水浴锅中，保温1 小时。进行限制性核酸内切酶酶切反应。

4.取装重组质粒的Eppdndorf 管内的酶切反应液15 微升，未酶切的重组质粒DNA 2微升，相应Mark 2 微升，分别进行点样，依实验一方法，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上拍下结果，观察酶切反应结果。

6.讲解及示范凝胶成像仪的使用。

五、酶切结果分析

观察凝胶成像仪上的酶切图谱，讨论重组质粒是否已酶切为原来的载体pUC18 质粒和PCR 产物的分子量图谱，新构建的质粒是否已重组成功。

六、问题

如果挑取含Apm、x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上长出的白色单菌落，抽提出的质粒，经过酶切鉴定后，没有出现重组成功的预期目标，请分析问题可能出现在哪几方面？

参考文献

[1]彭秀玲等，基因工程实验技术，湖南科学技术出版社，1987年第一版，1997 年第二版

[2]邹福强等，基因工程操作技术，广东科技出版社，1987，7 年第一版

[3]分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002，8 第一版，2003，1 第二次印刷，[美]J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译

[4]精编分子生物学实验指南，科学出版社，1998，6第一版，1999，10 第二次印刷，[美]F奥斯伯等著，颜子颖，王海林译

（周天鸿、李月琴编写）