1、切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。

2、再滴加间接荧光抗体（如兔抗人 -球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

对照染色：

①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。

②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。

③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：

①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。

③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。

④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。

⑤如③水洗。

⑥缓冲甘油封固，镜检。