热启动PCR

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。

限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。

Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94℃－ 95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。

Touch-down PCR

Touch-down PCR又称降落PCR.即选定一个温度范围，如50—35 ℃ ，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。

Touch-down的原理

随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。

选择初始复性温度的原则

起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度

Touch-down PCR的应用范围

low copy of targeted DNA;

high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers;

RT-PCR using oligo-dT.

RT-PCR

RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA 为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。

RNA扩增包括两个步骤

在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA。

cDNA第二链的合成方法有以下几种:

1、自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用。

2、置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效； (2) 直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化； (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。　

优化条件

模板

作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白和其他杂质。RNA中即使含有最微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白若未除干净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残留的RNase极易将模板RNA降解掉。

逆转录酶

1、目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。

2、普通逆转录酶反应温度为37-42度，然而一些有丰富二级结构的复杂模板或者高GC含量的模板在常温下扩增困难，需要将逆转录反应置于较高温度下进行改善扩增。对于较高的反应温度，建议使用cMASTER-RT酶，该酶在37-60度的温度范围内都能保持良好的活性，使用cMASTER-RT酶，可以增加反应产量，还可以增加逆转录反应的特异性。因为，对于使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时，较高的反应温度允许使用Tm值较高的基因特异性引物。

Taq酶

普通的Taq酶扩增能力很强但是错配率高，虽然高产但是最大只能 扩增3-5kb的片段；而本身带有校读功能的高保真酶有很高的保真度，不易出错，可扩增较长的片段，但是产量偏低。TripleMaster酶则是一个高保真的混合酶—在保留Taq酶的高聚合能力，保证高产的同时，还有效降低了Taq的错配率，大大提高了保真性。

RT-PCR buffer

引物：(1)上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3’端和下一个外显子的5’端，这样不会在基因组上扩出来。(2)设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和cDNA上得到的片段长度不一样，可以一引两用。

Random 9mers

适用于长的及具有Hairpin构造的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应 (用Random 9mers合成cDNA后，任何特异性的Primer pair都可用于PCR反应)。

Oligo dT-Adaptor Primer

适用于具有Poly(A)+ tail的RNA.

注： 原核生物的RNA、真核生物的rRNA及tRNA (某些种类真核生物的mRNA)不具有Poly(A) tail.本Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，用M13 Primer M4可进行3'-RACE.

一步法和两步法

一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA.该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。

两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR.两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。