我先说我有的质粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C 以及一个改造的PPIC9K载体，EcoRI和BamHI双酶切，C末端引入了一个6histag 菌株：GS115，KM71，X33，以及十几个空载体对照菌株 我的酵母表达Protocol： >10ug质粒用Sal线性化，加1/10体积的3M NaAC PH5.2和3倍体积的乙醇沉淀 70％乙醇洗一遍，20ul ddH2O重溶 按照公司手册做电转化感受态，一般OD600到1.1-1.3，0.2cm转化杯中电转化 每个样品涂5块左右10cm的MD板，一般有>1000个转化子 足够用不同浓度的G418板筛选，一般做0.5,1.0,2.0mg/ml梯度或干脆用1.0 然后每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑 离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了 一般1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测 一般都在蛋白的C末端加入了6个his，用抗histag抗体检测，4个小时出结果 和GS115空菌株做对照，根据阳性值高低判断蛋白表达量 挑选阳性值最高的克隆大量表达，纯化蛋白 从抽质粒做感受态开始，整个过程顺利的话两个星期内出结果 我一般连鉴定Mut+和Muts表型都省了，SalI线性化绝大部分都是Mut+表型 另外表达上清用TCA浓缩跑电泳鉴定也是一种方法，但是重复性不好 至于蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了