PCR － RFLP 法

1 ）提取细胞总 DNA

方法同前。

2 ） PCR 扩增引物的设计

1． 引物长度一般为 15 ～ 30bp ， G ＋ C 含量应在 45 ％～ 55 ％之间。

2． 应避免连续出现 4 个以上的单一碱基。

3． 不能含有自身互补序列。

4． 两个引物之间不应有多于 4 个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体。

5． 与非特异扩增序列的同源性应小于 70 ％，或少于连续 8 个互补碱基。

6． 扩增 HLA-D 区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子或高变区的边缘。

3 ） PCR 扩增

1． 每 100 μ l 反应体系中分别加入：缓冲液 10 μ l ，引物各 25pmol ， DNA 1 ～ 2 μ g ， 10 μ l dNTPs ，混合均匀后在 95 ～ 97 ℃变性 5 ～ 10min 。

2． 加 Taq DNA 聚合酶 2U ，液体石蜡 50 μ l 覆盖放置水分蒸发，将样品置 PCR 扩增仪中完成扩增反应，变性，退火，延伸温度时间及 Mg2 ＋ 的浓度随扩增引物及区段的不同而改变。

4 ）限制性内切酶消化

取 5 μ l PCR 产物分别用 2 个单位限制性内切酶（如 HinfI ）在总体积为 12 μ l 的反应体积中酶解， 37 ℃保温 2 ～ 3h 。

5 ）凝胶电泳

12 ％聚丙烯酰胺凝胶电泳， 200V ， 3h ，用 0.5 μ g/ml 溴化乙锭（ EB ）染色 30min ，照相分析图形。