1. 将 E.coli /phagelysate 以 1:10-20 稀释在 TBST溶液中。

2. 将 4 张 82mm 的 nitrocellulosemembranes（NC）浸入稀释后的 E.coli/ phage lysate中，室温下水平摇动 30 分钟，取出 NC 并使膜沥干。

3. 用 50mlTBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。

4. 用滤纸轻轻吸去膜上的液体。

5. 将膜放入 50ml 封闭液中，室温下水平摇动最少 30 分钟。

6. 将膜从封闭液中取出，用 50mlTBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。

7. 将血清按 1:5 稀释在 TBST 溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平 摇动 10 分钟。

8. 从血清稀释液中取出膜并丢弃，加入另外一张新膜，37℃下轻水平摇 10 分钟。

9. 重复步骤 8，直至所有 4 张膜都处理完。

10. 除去最后一张膜，收集血清（primaryantibody） ，分装成小份储存于-80℃冰箱中待用。

注意：

1. 该步处理过程是为了去除血清中能与细菌和噬菌体裂解蛋白进行免疫反应的抗体，这样可以减少假阳性率；

2. 一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于 4℃作短暂保存；

3. 可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，则需要至少10 个病人血清进行混合。