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油菜RNA的提取方法

关键词: 油菜 rna 提取 方法来源: 互联网

1.取新鲜植物叶片0.1g(研磨样品前可用水或酒精清洗样品)于2mL离心管中,在液氮或-80℃下贮存。
2.研磨:
在样品研磨前,提取液[饱和酚︰(0.1mol·L-1LiCl、100mmol·L-1 Tris-HCl PH8.0、10mmol·L-1 EDTA、1%SDS)=1︰1]于80℃浴预热,加入前,提取混合液上下颠倒混匀。
3.提取:
(1) 加入500µL80 提取液,30s涡流混匀;
(2) 加入250µL氯仿︰异戊醇(24︰1),30s涡流混匀;
(3) 置于冰上。
4.沉淀:
(1) 离心:12000rpm,4℃,5min。
(2) 预处理:300µL的4M LiCl(相当提取液的一半)。
(3) 取样品水相与LiCl 按1︰1混合(如溶液混浊可再离心)。
(4) 沉淀:混合液于-20过夜。
(5) 收集:12000rpm,4℃,15min。
5.分离:
(1) 弃上清,可剩余少量残留,
(2) 加100µL的DEPC水,用吸管上下混匀溶解沉淀。
(3) 加入10µL的3 mol·L-1 NaAc(pH5.2)和200µL的95%乙醇。轻缓涡流几秒,RNA储于-20℃或-70℃过夜。
6.洗涤:
(1) 12000rpm,4℃,15min, 弃上清。
(2) RNA沉淀用70%乙醇洗涤,12000rpm,4℃,5min后轻弃上清,旋转吸取液体。
(3) RNA于通风橱放置15min风干,并确保无水进入。
7.悬浮:
12µL的DEPC水溶解沉淀,储于-20℃或-70℃。
RNA提取完成后,利用琼脂糖凝胶检测RNA质量。
琼脂糖变性胶的制备:2.4g琼脂糖,150mL水,20mL的10×mops缓慢加热至沸(小心溢出)。冷却至50℃,加入30mL甲醛,总量200mL。
样品处理:
(1)、2µL RNA悬浮液(0.5µg·µL-1);
(2)、3µL 变性缓冲液(10×mops︰甲醛:甲酰胺=1︰1.5︰5);
(3)、0.6µL LB(1mmol·L-1 EDTA pH8.0 ,50%甘油,0.25%溴酚蓝,0.25%混二甲苯)。
混合后置于65℃干浴5min后于冰上。
上样混合液按①︰②︰③=1︰1.5︰0.3比例混合。
1µL的RNA上样混合液可在加热前/后加入,电解液为1×mops,并且高于稍胶面,电压小于500mA。

(责任编辑:大汉昆仑王)
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