实验四十六 抗药性突变株的分离

　　一、目的要求

　　学习用梯度培养皿法分离抗药性突变株。

　　二、基本原理

　　微生物的抗药性突变是 DNA分子的某一特定位置的结构改变的结果，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段。因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上接种大量的细胞群体，在这些细胞群体中只有极个别具有抗性突变的菌株才能在平板上形成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株。抗药性菌株常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性菌株方法是十分必要的。

　　筛选抗药性突变菌株的方法很多，梯度培养皿法就是其中的一种。把培养皿斜放，倒入不含药物的培养基底层，凝固后将培养皿平放，再倒入含有药物的培养基上层，这样便得到药物浓度由一边向另一边逐渐降低的培养基。在此培养基上涂上大量敏感菌，经培养后，就会出现在低浓度药物部位长满了微生物，而在高浓度药物部位，微生物生长受到抑制，只在中间部位才出现少量的抗性菌落，如图Ⅺ-3。

　　三、器材

　　枯草芽孢杆菌1．398；酪蛋白培养基，链霉素，无菌生理盐水，无菌玻璃涂棒等。

　　四、操作步骤

　　1．菌悬液制备

　　取培养24小时的枯草芽孢杆菌1．398斜面一支，用无菌吸管加入4ml无菌生理盐水，将菌苔洗下，制成菌悬液。

　　2．梯度平皿制备

　　倒10ml已溶化的不含药物的酪蛋白琼脂培养基于已灭菌的平皿中，立即将平皿的一端垫高，使高端的培养基的表面正好达到培养皿的底与边的交叉处，待培养基凝固后，将凝固的平皿平放于水平位置，再在底层培养基上加入每毫升含有100μg的链霉素的酪蛋白琼脂培养基10ml，凝固后，便制得一个链霉素浓度从一端的0μg/ml到另一端的最高浓度100μg/ml的浓度梯度的平皿，并标记两端显示浓度梯度的方向。

　　3．分离抗性突变菌株

　　吸取0．1ml枯草芽孢杆菌1．398菌悬液到已凝固的梯度平皿表面，用无菌玻璃涂棒涂匀，置37℃温室中培养48小时。

　　培养48小时后，用接种环挑取最高抗生素浓度处生长的单个菌落接种到斜面上，以作抗性水平考核之用。

　　4．抗性水平考核

　　将上述得到的抗性菌株制成菌悬液，再分别接种到每毫升中含链霉素40、60、100、120、150μg的酪蛋白琼脂培养基平皿上，置37℃温箱中培养2—4天，观察生长情况，确定抗性水平。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　将实验结果填入下表。“ ”表示生长；“-”表示不生长。

　　抗性水平是多少？

　　2．思考题

　　抗性突变的发生是因药物的存在而引起的吗？用实验加以说明。