实验三 暗视野光学显微镜

　　一、目的要求

　　1．了解暗视野显微镜的基本原理及用途。

　　2．学习并掌握使用暗视野显微镜观察微生物样品的基本技术。

　　二、基本原理

　　生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。暗视野显微镜的原理与来自缝隙的一束强光通过暗室时，可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的，即给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品上反射或折射的光进入物镜，那么，在漆黑的视野中，由于反差增大了，使样品能够看得更清楚。因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体，故在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。

　　暗视野显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器，在聚光器的下方中央为圆形黑盘所遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光可进入物镜，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。如无暗视野显微镜时，只需将明视野显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可；也可在明视野显微镜聚光器下面的滤光镜支架上放一片星形挡板（star diaphragm）（图Ⅲ-6）构成暗视野，这种方法适用于低倍镜观察。

　　在暗视野中，由于有些活细胞其外表比死细胞明亮，所以暗视野也被用来区分死、活细胞，此技术现已被用于各种酵母细胞的死、活鉴别。此外，暗视野显微镜对于观察娇弱的微生物，如梅毒密螺旋体（Treponema pallidum）特别有用。

　　三、器材

　　酿酒酵母（Saccharomy-ces cerevisiae）；

　　暗视野显微镜，载玻片，盖玻片，无菌水。

　　四、操作步骤

　　1．选厚薄在1．0—1．2mm的干净载玻片一块，滴上酿酒酵母悬液，加盖玻片（注意切勿有气泡存在）。

　　2．将聚光镜光圈调至1．4。

　　3．光源的光圈孔调至最大。

　　4．在聚光器上放一大滴香柏油，将标本置载物台上，旋上聚光器使油与载玻片接触（不能有气泡发生）。

　　5．用低倍物镜及7×目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点（图Ⅲ-7），光点愈小愈好，由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。

　　6．换上所需目镜和高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。

　　7．在盖玻片上滴一滴香柏油，并将油镜转至应在位置调节配光，进行观察。

　　五、注意事项

　　1．进行暗视野观察时，聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射，达不到被检物体，从而不能得到暗视野照明。

　　2．在进行暗视野观察标本前，一定要进行聚光镜的中心调节和调焦，使焦点与被检物体一致。

　　3．由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大（ NA=1．2—1．4），焦点较浅，因此，过厚被检物体无法调在聚光镜焦点处，一般载玻片厚度为1．0mm左右，盖玻片厚度宜在0．16mm以下，同时载玻片、盖玻片应很清洁，无油脂及划痕，否则都会严重地扰乱最终的像。

　　六、实验报告

　　思考题

　　（1）观察活细胞的个体形态，你认为用显微镜的明视野好？还是暗视野好？为什么？

　　（2）你所观察到的酿酒酵母，在暗视野中能否区分死、活细胞？

　　（3）暗视野观察时，所用的载玻片、盖玻片有何要求？为什么？