MTT比色法检测IL-2的生物活性
MTT 比色法检测IL-2的生物活性 【基本原理】 IL-2的生物活性检测法是检测IL-2对靶细胞(或反应细胞)的促增殖作用的能力。IL-2反应细胞增殖程度可以增殖细胞中DNA合成或酶活性为指示系统,通过测定3 H-TdRDNA掺入量或MTT比色法OD值,并通过与标准品对照,间接测定IL-2的生物活性单位。以下三类细胞可作为IL-2的检测细胞:①IL-2依赖细胞株,如CTLL,CTLL-2,尤以后者最常用;②有丝分裂原活化的T淋巴母细胞;③小鼠胸腺细胞。下面主要介绍以CTLL-2细胞作为反应细胞检测IL-2的生物学活性,又包括MTT比色法与3 H-TdR掺入量两种基本方法,其原理参见IL-1的生物活性检测部分。 【材料和试剂】 (1) CTLL-2细胞:作为反应细胞或靶细胞。 (2) 待测样品:从1:2开始作倍比稀释,至少6个稀释度。 (3) IL-2标准品:同上作倍比稀释,至少6个不同稀释度 (4) 10% FCS-RPMI-1640完全培养液 (5) MTT:用PBS配成浓度为5mg/ml的MTT溶液,用0.22μm滤膜过滤除菌及杂质,4℃避光保存。 (6) 酸化异丙醇:100ml异丙醇中加入0.4ml 36%HCl即可成为0.04mol/L HCl的异丙醇。 (7) 96孔细胞培养板,刻度吸管、毛细吸管,加样器(头),刻度离心管,离心机,细胞计数板,倒置显微镜,超净工作台,CO2 培养箱,酶标测定仪,570nm和630nm滤光片。 【操作步骤】 (1) 用10% FCS-RPMI-1640完全培养液洗涤CTLL-2细胞2次,1000r/min离心5min,以去除原生长培养液(含有IL-2); (2) 用10%FCF-RPMI-RPMI-1640培养液调细胞浓度为1×105 /ml; (3) 将不同倍比稀释度的IL-2的标准品及待测样品分别加入96孔培养板中,100μl/孔,各设3复孔,并同时设培养液对照; (4) 各孔内均加入CTLL-2细胞悬液,100μl/孔; (5) 置37℃,5% CO2 培养箱中培养24h(18-24h均可); (6) 细胞培养至18-24h时,各孔加入MTT溶液,10μl /孔继续培养4h; (7) 取出培养板,先从各孔中轻轻吸出100μl上清液弃去。再加入酶化异丙醇或DMSO,100μl/孔,置室温10-20min,吹打震荡,充分混匀,使MTT-甲肷产物充分溶解; (8) 用酶标仪的检测波长570nm,参考波长630nm,分别测定各孔OD值,测定应在加入酸化异丙醇后1h内完成。 【结果分析】 (1) 每孔OD值应取3复孔的平均值,最终各孔OD值应为OD570 nm-OD630 nm,再减去培养液对照孔OD值; (2) 按概率单位分析法计算IL-2活性单位(参见IL-1的生物活性检测法部分):样品IL-2活性单位采用下列公式计算:
样品IL-2活性单位(U/ml) | = | 达标准品最大OD值50%的样品稀释度 | × | 标准品IL-2活性单位 (U/ml) |
达最大OD值50%对应的标准品稀释度 |
【注意事项】 (1) CTLL-2细胞存活率应>95%(细胞折光性好,形态饱满),洗涤时操作不要太猛烈,因CTLL-2细胞膜极脆,容易破碎而影响检测结果。 (2) CTLL-2细胞要充分洗涤,因原生长培养液中含有IL-2。 (3) CTLL-2细胞对鼠IL-4亦有增殖反应,若样品中含有鼠IL-4,将影响检测结果准确性,此时可用抗鼠IL-4 McAb处理待测样品后再进行检测。但CTLL-2细胞对人IL-4无增殖反应。 (4) CTLL-2的最佳终浓度宜为1×104 /孔,且应均匀分布。 (5) CTLL-2细胞冻存后复苏较为困难,而长期培养又易产生变异而干扰IL-2活性测定,应加以注意。 (6) IL-2标准品及待测样品从1:2开始至少6个倍比稀释度,加样时应从低浓度到高浓度顺序加入,且不可共用加样器头。 (7) 加入MTT的最佳时间应为培养液对照(无IL-2)孔细胞全部死亡时,一般时间是细胞培养至18-24h时。 (8) 加入酶化异丙醇后,应在1h内进行OD测定。如果1h内无法测定,可将未加酸化异丙醇的96孔培养板暂时放入4℃冰箱保存。测定前,取出置室温下数分钟,再加入酶化异丙醇进行OD值测定。 (9) 因RPMI-1640培养液中含有的酚红可干扰OD值测定,而加入酶化后的异丙醇,可使培养液中的酚红在酸性条件下由红色变成黄色,从而可排除红色对OD值测定的干扰;此外,设立培养液对照,可进一步排除培养液对OD值测定的影响。 (10) IL-2活性单位计算方法有多种,除在IL-1活性单位计算法中所述的方法外,还可通过正态概率纸法、概率单位法计算IL-2活性单位,亦可对结果进行计算机处理,得出IL-2的活性单位。有关计算方法可参阅医学统计学的有关内容。
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