按细胞比重分离B细胞

1． 将 2 ～ 3ml 含 3 × 107 纯化的 B 细胞（ B 细胞 >90 ％）的细胞悬液加到 3ml Percoll 溶液（比重 1.074 ）上，水平离心 1000 × g 20 分钟。

2． 吸去无细胞上清液，交界面的低密度 B 细胞和大部分 Percoll 溶液。由于此时细胞沉淀非常松散，需留下约 0.2ml Percoll 溶液以防吸去了沉淀细胞。轻敲离心管，用留下的液体悬浮高密度 B 细胞。

3． 用洗涤液分别洗涤低密度 B 细胞和高密度 B 细胞两次，每次离心 500 × g 10 分钟。最后，测定细胞数和细胞活力，用 1 ～ 2ml 含 5 ％小牛血清的洗涤液将细胞配成适当浓度。

用尼龙毛法分离 B 细胞

1 ）尼龙毛柱的制备

1． 取直接 3D ，长度约 10cm 的尼龙毛，用 0.2mol/L HCl 浸泡处理过夜。用双蒸水洗净 HCl ，置 37 ℃烘干备用。

2． 称取 50mg 尼龙毛，均匀分散，置 Hanks 液中浸泡。取 1ml 注射器，出口接塑料管并夹住。将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约 5 ～ 6cm 。此柱可分离约 2 × 107 细胞。将柱置－ 20 ℃可保存 2 ～ 3 个月。

2 ）分离细胞

1． 取分离的单个核细胞，用细胞培养液将细胞配成 2 × 107 /0.5ml 。

2． 融化尼龙毛柱，以每分钟 5 ～ 7 滴的速度放出 Hanks 液，并用 5ml 预温至 37 ℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。小心将细胞悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加 0.2ml 细胞培养液，夹住塑料管。

3． 在 37 ℃ 5 ％ CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中静置 1 小时。用 5ml 预温至 37 ℃的细胞培养液洗脱细胞。洗脱液中含有纯的 T 细胞。再用 5ml 预温至 37 ℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱，洗净不粘附的细胞。

4． 加入 0.5ml 细胞培养液，夹住塑料管，将尼龙毛柱置冰箱中冷却。用 4 ℃预冷的细胞培养液分 3 ～ 4 次洗脱尼龙毛柱，每次 0.5ml 。可先夹住塑料管，用玻璃棒或金属丝反复挤压尼龙毛以利粘附细胞脱落，然后再洗脱。洗脱液中含有大量 B 细胞。离心 1000 × g 10 分钟，去上清液，用细胞培养液同样洗涤细胞 1 次。计数细胞，用细胞培养液将细胞配成适当浓度。