大鼠细小病毒抗体(RPV-Ab) 酶联免疫分析（ELISA ）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用         目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中 细小病毒抗体(RPV-Ab) 的含量。

实验原理：

    本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法（ ELISA ）测定标本中 大鼠 细小病毒抗体 (RPV-Ab) 。用纯化的大鼠细小病毒 (RPV) 抗原 包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中细小病毒抗体 (RPV-Ab) 相结合 ，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后 再与 HRP 标记的细小病毒 (RPV) 抗原 结合，形成抗原 - 抗体 - 酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中 大鼠 细小病毒抗体 (RPV-Ab) 的存在与否。

试剂盒组成 ：

样本处理及要求 ：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃ 的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃ 保存，但 应避免反复冻融 .

7. 不能检测含NaN3的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。

操作步骤：

1.         编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、 阳性对照 2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.         加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50μl 。然后在 待测样品孔先加样品稀释液 40 μl ，然后再加待测样品 10 μl 。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.         温育：用封板膜封板后置 37 ℃ 温育3 0 分钟。   

4.         配液：将 30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 600ml 后备用

5.         洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶标试剂 50μl ，空白孔除外。

7.         温育：操作同 3 。

8.         洗涤：操作同 5 。

9.