PCR的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。

引物设计

所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线设计，也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。

有了软件就该讲讲怎么设计了

引物设计的原则

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：

一、典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

二、选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。

三、设计5'端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

四、避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑惑，究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时，PCR 产率可达100%， ? G=-6 时，为40%。

五、避免3'末端富含GC.设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。

六、避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配。

七、避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

八、引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T），这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物，也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的Tm, 也可用于扩增产物的Tm 计算。

Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。

九、当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择。

若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

十、有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。特别要注意的是：不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3 个碱基的退火足以在错误位点起始PCR.使用较高的引物浓度（1μM 到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

说了半天了，想起来还得提醒大家一句:千万别搞错了引物的位置！这句话似乎多余，可是事实上，不时能看到一些朋友一不小心就犯错!

看了上面的图吧，如果要扩增目的序列为”ATG··· ··· ··· ···TGA”的片段，则引物分别为“ATG··· ··· ”和“TCA··· ···”仔细琢磨一下，特别是5’端再接上酶切位点可别搞错了！

设计好了引物就要让公司合成，这时候别忘了谈价格：）现在竞争很厉害，价格已经挺便宜了，注意两个参数：一个是OD 值，如果公司说1OD 能比2OD 优惠，那通常1OD 足够了。第二是纯度，是HPLC 的还是OPC 的，事先要说好，建议看看这里（唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不错）

引物设计方面还有很多话题可说，比如如何利用引物搭桥将两个片段通过PCR 而不是酶连接起来、如果要设计引物表达蛋白时注意“N 端规则”??这些有趣的话题可以见论坛内相关讨论，这将是我们推出“原核表达”专辑时的内容。