放射免疫分析技术(用核素标记的抗原检测抗原)   【基本原理】     放射免疫分析技术（radioimmunoassay，RIA）一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为放射性标记抗原和被测抗原（或标准品）对有限的特异性抗体发生可逆性的竞争结合反应，最终形成的放射性抗原-抗体复合物量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时，免疫复合物的形成就受到待测抗原含量的制约。如反应系统中待测Ag含量高时，对Ab的竞争结合能力就强，Ag-Ab复合物的形成量就会增加，Ag*-Ab复合物则相对减少；反之，当待测Ag含量低时，对Ab的竞争结合能力弱，Ag*-Ab复合物的形成量即增多。 【基本试剂及材料】 （1）标准品：是竞争放射免疫分析的定量依据，标准品应尽量与待测抗原的化学结构完全相同。在某些特殊情况下，也可用结构相似，与抗体亲和力相近的物质代替，但必须列出其换算系数。 （2）多克隆或单克隆抗体 （3）放射性标记物 （4）分离剂：用于将结合和游离的部分分离。 （5）γ计数仪 【操作方法】 以测定血清中胰岛素含量作为实例 （1）按下表逐一加样（加样量为ml，均设双复管）                          标准管（mU/ml）                     检测管                    0    10    20    40    80    160         标准品（不同浓度）100   100   100   100   100   100    待测血清                                                     100                     抗血清（一抗）    100   100   100   100   100   100          100 分析试剂          100   100   100   100   100   100          100                    混匀，第一次温育，37℃温育60min 核素标记的胰岛素  100   100   100   100   100   100          100                    混匀，第一次温育，37℃温育60min 第二抗体          100   100   100   100   100   100          100                    混匀，第一次温育，37℃温育60min     *分析试剂为0.05mol/L， pH7.4 PBS， 内加1%-2% （2）正常兔血清离心洗涤后，用γ计数仪分别测量各管沉淀物的放射性强度，以两管cpm的均值表示； （3）以0mU/ml标准管的cpm为B0，分别计算结合率（B%，即B/B0 ´100%）； （4）用B%为纵坐标，不同浓度的胰岛素标准品为横坐标绘制标准曲线，然后根据检测管的B%，从标准曲线中即可查得相应的胰岛素含量。 【注意事项】 在RIA反应中，标记抗原与抗体结合后，必须分离结合抗原和游离的放射性标记物，然后分别对游历部分和结合部分的放射性进行测定。因此选择合适的分离剂和方法十分重要，要求分离效率高，重复性好，非特异性结合率低，来源方便和经济实用。在上述胰岛素测定液相分离技术中，是以第二抗体作为分离剂（双抗体法）。第二抗体法的优点是特异、稳定、非特异性结合低；其缺点是抗体用量大，费用高和受血清蛋白浓度的干扰。除第二抗体法外，还有用饱和硫酸铵或硫酸钠作为分离剂的盐析共沉淀法；以活性炭末、硅胶微粒等吸附游离抗原的吸附法；以及利用聚乙二醇（PEG 6000）、二氧六烷等作为沉淀剂。使用此类分离剂虽然方法简便，价廉易得，但均为非特异性分离技术，易受环境温度、pH值、试剂浓度等因素的影响，非特异性结合率较高。近年来，研究较多和分离效果较好的是固相分离技术，即将特异性抗体或第二抗体，以物理吸附或共价键结合法与聚苯乙烯试管、塑料小珠、琼脂糖珠和磁性微球等固相载体连接，制成特异性固相吸附剂。此类方法稳定性好，使用方便，不受一般非特异性因素影响。