基因工程抗体分泌型表达
基因工程抗体分泌型表达 在表达载体上装入信号肽序列,可以使抗体片段分泌到细胞外或周质腔。在表达时抗体完成切断信号肽,蛋白质折叠,二硫键形成,重、轻链的正确装配等一系列过程,能形成有活性的抗体分子。信号肽可利用已知的PelB以及碱性磷酸酶(PhoA);外膜蛋白A(OmpA);A-溶血素蛋白(HlyA)等,将抗体基因两条链分别融合到一种或两种信号肽后面,或者同时融合到同一种信号肽后面。融合点被断裂后必需能产生正确的N端。分泌到周质腔的抗体能正确地折叠和二硫键的形成,另外由于周质腔的蛋白酶较少,减少了对抗体的降解。为提高表达量可以选择蛋白酶缺陷宿主菌(LonHrpi),降低诱导温度,调整培养基状态等条件。 【材料和试剂】 (1) 载体pWAI80。 (2) 抗体VH、VL基因。 (3) 大肠杆菌JM83。 (4) IPTG。 (5) SB培养基。 【操作步骤】 (1)将VH、VL基因插入载体pWAI80,构建成ScFv抗体,此载体称pFS80。 (2)接种单菌落(pWAI80)于10ml SB培养基中(含Amp 0.1mg/ml;20mmol/L MgCl2 ),37℃培养至OD600 达到0.2左右,加1mmol/L IPTG,30℃诱导表达8~12h。 (3)4000r/min离心10min,收集菌体和培养基上清,将菌体悬浮于0.1体积的PBS中,经过液氮冻结5min,37℃融化,反复冻融4次,12000r/min离心10min,收集上清。同时与培养基上清一起测定活性,或纯化后鉴定。可以加蛋白酶抑制剂(PMSF)0.1mg/ml保存。
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