间歇循环刺激法制备抗原特异性T细胞克隆
间歇循环刺激法 是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法,即经抗原间隔刺激多个循环。
[材料和试剂]
(1)抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC
(2)抗原
(3)含10%人AB型血清的完全RPMI 1640培养液
(4)细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材。
[操作步骤]
(1)抗原刺激:于24孔培养板加入单个核细胞5×106 /2ml/孔和最适浓度的抗原,置37℃,5%CO2 温箱培养7d。
(2)间歇循环刺激:
①重悬经过抗原刺激的细胞,并经密度梯度离心,收集界面层细胞,用无血清的RPMI-1640洗二次;
②调整细胞浓度至1×106 /ml,加入24孔培养板孔中,同时各孔加入经过照射的自身MNC 4×106 ,以未照射的自身细胞作为饲养细胞和抗原提呈细胞,培养7d;
③同步骤①收集和洗涤细胞;
④调整细胞浓度至1×106 /ml,与2~3×106 新鲜照射的自身MNC及抗原共同培养7d;
⑤重复步骤②~④共3个循环;
⑥收集细胞,通过增殖试验测定抗原的特异性。
(3)T细胞克隆:间歇循环刺激培养的细胞经有限稀释,于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液,同时克隆板孔中加入104 经过照射的自身MNC、IL-2 30U和适当浓度的抗原,同上述条件培养7~10d,显微镜下观察细胞生长情况。将生长良好的抗原特异性细胞转至24孔板孔中,加入自身饲养细胞和抗原,继续培养7d,传代并经间歇刺激培养。
[注意事项]
(1)上述方法制备的T细胞克隆未区分出CD4+和CD8+T细胞,二者均可能被克隆
(2)在有限稀释之前,IL-2的量不宜过高,否则可能发生T细胞非特异性增殖
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