嵌合(杂合)病毒载体介导的基因转移     近几年发展起来的嵌合(杂合)病毒载体(chimeric or hybrid viral vectors)是基因治疗载体研究的一个重要方面，其中心思想是利用分子生物学技术把两种或两种以上的病毒载体结构组合起来，产生更优化的嵌合(杂合)病毒载体。下面简要介绍几种嵌合载体的研究情况。     (1)单纯疱疹病毒/腺相关病毒嵌合载体：在单纯疱疹病毒/腺相关病毒嵌合载体中，所使用的单纯疱疹病毒载体己去除了所有病毒基因，只保留了复制起始序列和病毒包装信号序列，并插入了腺相关病毒的rep基因和两端的ITR序列，目的基因则插在腺相关病毒的两个ITR之间。这样的载体既具有单纯疱疹病毒能够进入并定位于细胞核的特点，又具有腺相关病毒能够扩增外源基因并将其整合在人类非分裂细胞染色体特定位置的特点；同时，也克服了前者不兼容外源启动子的弱点，避免了后者包装容量低的不足。离体实验证明，受单纯疱疹病毒/腺相关病毒嵌合载体感染的分裂细胞经过一定时间的选择后，可以形成稳定表达目的基因的细胞克隆，且对细胞的毒性很小。     (2)腺病毒/腺相关病毒嵌合载体：这类载体是在第二代腺病毒载体的基础上插入了腺相关病毒的ITR序列，但rep基因并不包含在载体框架中，而是通过poly―Lys偶联在病毒颗粒表面。该载体既具有腺病毒感染效率高、制备容易的特点，又可在rep基因短期表达的帮助下像腺相关病毒一样发挥定点整合的作用。但目前尚无实验证明这类载体可以长期表达外源基因。如果使用去除了所有腺病毒基因的第三代载体作为框架，再插入腺相关病毒载体的顺式作用元件，并将rep和cap两个基因置于可调控启动子如Tet―on启动子的控制之下，用四环素诱导rep基因短期高效表达，也许更能发挥两种病毒的综合优势。     (3)单纯疱疹病毒/EB病毒嵌合载体：将EB病毒(Epstein―Barrvirus，EBV)的。ri―P元件和EB病毒核抗原―1(EBVnuclearantigenl，EBNA―1)基因插入已去除所有病毒基因但带有必需的病毒/顷式作用元件的单纯疱疹病毒载体中，这种载体感染细胞后其DNA可以像EBV一样成为染色体外的自主遗传单位。将这种载体与辅助性单纯疱疹病毒共转染包装细胞，包装出的病毒中重组嵌合病毒占93％。若带有选择基因，被感染细胞在选择压力下获得的细胞克隆在培养液中可保持抗性达6个月以上。     (4)腺病毒/反转录病毒嵌合载体：这种载体首先由美国的MeizhenFeng于1997年构建成功并应用于离体研究。这种载体由两个腺病毒载体构成，其中一个腺病毒载体内插入了反转录病毒LTR、包装信号及目的基因片段，另一腺病毒载体内插入了所有编码反转录病毒反式作用因子的基因。这两种载体分别通过转染HEK293细胞后大量制备，然后共转染同一种靶细胞，第一个载体在第二个载体的帮助下可以产生带有目的基因的有感染能力的复制缺陷型重组反转录病毒，并分泌到细胞外继续感染其他正在分裂的细胞。由于首先被嵌合病毒感染的细胞可以包装出带有目的基因的重组反转录病毒，并直接感染周围的细胞，因而其感染效率大大超过了一般的反转录病毒。而且，这种嵌合病毒不是通过反转录病毒的包装细胞如PA317细胞而是由腺病毒的包装细胞包装生产，因而可以达到很高的滴度。所以，这是一种应用潜力很大的病毒载体。