一、目的：

学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

二、原理：

等电点聚焦（isoelectric focusing，IEF）或简称电聚（electrofocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

等电点聚焦电泳产生pH梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300～1000之间，各组分的等电点（pI）既有差异又相接近，pI的范围在2.5～11之间。

R1和R2为氢或带有氨基的脂肪基。这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。目前，载体两性电解质商品在使用时还存在一些问题，如样品中的盐浓度对pH梯度有影响等，但毕竟优点很多，仍然得到广泛应用。

分析载体两性电解质的结构可知，它既有酸性基团（-NH3+ )，也有碱性基团（-COO-），既可接受分子，也可释放质子：

它们在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷。当它们所带的正负电荷相等时，其净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH值为该两性电解质的等电点，以pI表示。所以两性电解质的等电点在数值上等于它呈电中性时溶液的pH值。等电点是反映两性电解质在溶液中得失质子的能力，是它的物化性质。两性电解质在溶液中的行为可以从两方面看，一方面溶液的pH决定它带电荷的性质。如溶液是pH7，对pI=9的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI=3的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pI的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：

使溶液pH有所改变。当某一两性电解质pI较低，即释放质子（H+）能力较强，使溶液pH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，pI高的可使溶液pH值上升，称为碱性两性电解质。所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其pH值有所改变。