一、目的

蛋白质分子有单链、双链和寡聚蛋白等组成形式，组成蛋白质分子的单条肽链又称亚基。通过对天然蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的比较，可以研究种子蛋白质分子组成和结构。

另外，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定亚基分子质量的好方法。通过本实验，学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、技术和实际应用。

二、原理

用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（琉基乙醇或二硫苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生1：1.4的定量结合。SDS使蛋白质亚基带上大量负电荷，掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。

亚基的构象均呈长椭圆棒状，各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度。在电场中其迁移速率仅与亚基分子质量有关，因此，SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳可以进行蛋白质亚基分离，并用来测量蛋白质亚基的分子质量。

三、仪器、试剂和材料

1．仪器

( 1)稳压稳流电泳仪

( 2)垂直板电泳槽

( 3)微量注射器

( 4)烧杯50ml X2

( 5)白瓷盘

( 6)脱色摇床

( 7)吸管0.5ml X 2 ，5mlx2，10mlx3

( 8)真空泵

( 9)台式高速离心机

2．试剂

( 1 ) 2%琼脂2g 琼脂加电极缓冲液100ml，水浴中溶化。

( 2)电极缓冲液Tris 6g ，Gly28.8g ，SDS 2g ，去离子水溶解后，用HCl调pH值至8.3，水定容至2000ml 。

( 3 ) 30% Aer Acr 30g，水溶后定容至100ml，过滤，冰箱中贮存备用。

( 4 ) 1% Bis Bis 1g ，水溶后定容至100ml，过滤，冰箱中贮存。

( 5)分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris，pH8.7）Ths 15.17g，适量水溶解，然后用lmol/L HCI调pH 值至8.7，定容至100ml 。

( 6)浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-Hcl，pH6.8）Tris 6.06g ，适量水溶解，然后用1mol/L HCI 调pH值至6.8，定容至l00ml。

( 7 ) 10%SDS SDS1g，加水10ml溶解。

( 8 ) 10%过硫酸铵 1g过硫酸铵，加水10ml溶解，现用现配，冰箱中最多可贮存一周。

( 9 ) TEMED（四甲基乙二胺）4℃，棕色瓶中贮存。

( 10)样品缓冲液（pH8.0）Tris 6.05g，甘油50ml，巯基乙醇25ml，溴酚蓝0.5g，SDS l0g，溶于水，用HCI调PH至8.0，定容至500ml。

( 11)脱色液 甲醇：乙酸：水＝5：1 ：5（体积比）

( 12)染色液（0.25%考马斯亮蓝R250）1.00g考马斯亮蓝R250，用脱色液400ml溶解，过滤备用。

( 13)低分子质量标准蛋白溶液，包括溶菌酶（MW=14400Da）大豆胰蛋白酶抑制剂（215000）、碳酸酐酶（310000）、卵白蛋白（450000）、牛血清白蛋白 (662000）、磷酸化酶B (925000）。用样品缓冲液配成2mg/ml溶液，在沸水浴中加热3～4min，冷却后使用。