嗜酸性粒细胞的分离
嗜酸性粒细胞在支气管哮喘、过敏性鼻炎等发病过程中起重要作用,研究其功能需要制备高纯度和高活力的嗜酸性粒细胞。以下介绍一种根据中性粒细胞膜选择性表达FcγRIII(CD16),采用包被有抗CD16单克隆抗体的磁珠,通过负性选择方式快速简便的分离脐血嗜酸性粒细胞的方法。
试剂及配制
1. 各种比重的聚蔗糖-泛影葡胺分离液 A液:12% 比重1.090的聚蔗糖-泛影葡胺分离液 B液:9.0% 比重1.076的聚蔗糖-泛影葡胺分离液 C液:6.4% 比重1.065的聚蔗糖-泛影葡胺分离液
2. 6%葡聚糖
3. 抗CD16的免疫磁珠
4. 0.01mol/L PBS
操作方法
1. 取以0.1mol/L,pH7.7 EDTA抗凝的新生儿脐血100ul,加嗜酸性粒细胞染液0.9ml,进行计数后,其余血液按1:5比例加入6%葡聚糖,混匀置37℃ 水浴40min,取上清离心,浓缩待用;
2. 依次缓慢加入各种比重的聚蔗糖-泛影葡胺分离液A液、B液、C液以及待分离的白细胞浓缩液,2000r/min离心20min,细胞分成上、中、下和底部4层,吸出富含嗜酸性粒细胞的下层,用0.01mol/L PBS洗2次并计数细胞总数;
3. 每107 个细胞加4℃预冷的抗CD16免疫磁珠20ul,混匀,6~12℃保持15min,2次通过置于磁珠分离器(MACS)强磁场中的分离柱。与抗CD16免疫磁珠结合的中性粒细胞则被阻滞于分离柱内,而未标记的嗜酸性粒细胞流出柱口;
4. 嗜酸性粒细胞用0.01mol/L PBS洗1次,其中混有少量红细胞,用0.83%氯化铵溶解除去。以上每一步均作嗜酸性粒细胞染色计数,最后用台盼蓝拒染法观察细胞活力。
** 该法分离纯化得到的脐血嗜酸性粒细胞平均纯度、获得率和活力均较高,分别为97.2%、60.7%和97%以上,因采用负性选择方式,故纯化的嗜酸性粒细胞功能几乎不受影响
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