噬菌体展示技术基本原理       噬菌体展示技术（phage displayed technology，PDT）是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。1985年Smith，G.P提出将外源基因插入改建过的噬菌体外壳蛋白基因，表达含有外源蛋白或多肽的融合蛋白，这种带有融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体。通过吸附-洗脱-扩增的重复过程，将含有能与靶蛋白特异结合的外源蛋白的噬菌体从表达各种外源蛋白的噬菌体库中筛选出来，然后进行富集、扩增及基因序列测定，推断外源蛋白的氨基酸组成。该技术将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选新技术。目前已成功应用于抗原表位分析，单抗筛选，蛋白质功能拮抗多肽或模拟多肽的确定等。在药物筛选、疫苗设计等方面发挥重要作用。 蛋白质分子间相互作用研究表明：相互结合的两个分子间少数几个关键基团的弱相互作用提供了绝大部分的结合能力；含有与结合有关的几个关键基团的线性短肽可以模拟蛋白质分子相互作用部位的空间构象。在肽类分子与蛋白质分子的识别并结合过程中，肽的最佳长度在8~12个氨基酸之间，其中起作用的是5~8个氨基酸残基，甚至2个或3个核心氨基酸残基。因此，通过合理设计而合成的短肽可以表现出原蛋白的某些活性。这一研究的发展为噬菌体肽库的构建及应用奠定了基础。       噬菌体展示技术的应用原理 将待筛选基因（数量可在109以上）插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因VIII或基因III之间，每一个噬菌体只含有一个外源基因，即可构建成含有109种融合蛋白的噬菌体肽库，每一个噬菌体只表达一种外源肽或蛋白，且呈现在噬菌体表面，而且不影响噬菌体的完整性。利用展示的多肽与目的蛋白（主要是抗体、抗原及一些细胞生长因子受体等）或其他生物大分子亲和的性质可高效率地筛选出特异多肽。即先将靶蛋白固相化，如结合在塑料板（96孔板）上，加入文库噬菌体与之反应。经过洗涤，未结合的噬菌体被洗掉，有亲和力的噬菌体即被俘获，俘获的噬菌体经洗脱后再感染大肠杆菌进一步扩增。这样一种“吸附-洗涤-扩增”的富集过程称为淘筛。一轮淘筛可以使噬菌体富集103倍，经过几轮淘筛就能从109~1010 的噬菌体肽库中筛选得到与靶蛋白相互作用的短肽，一般要进行3~4轮淘筛。亲和筛选的关键在于靶蛋白与短肽间的特异性结合，但往往由于一些原因，如短肽的多价表达，使得一些非特异结合的短肽也被筛选出来。为了增加筛选的特异性，在筛选的过程中都是不断地降低筛选配基的浓度，从而保证被筛选得到的短肽与靶蛋白有较强的亲和力，即它们的结合是特异性的。       噬菌体展示载体构建原理     1.大肠杆菌丝状噬菌体简介  用于噬菌体展示的表达载体主要是丝状噬菌体。大肠杆菌丝状噬菌体是一类单链环状DNA病毒，主要有M13，fd和fl三种。丝状噬菌体只感染雄性，即带有F因子或F¢因子的大肠杆菌菌株。在感染时，噬菌体通过P3蛋白的N端与雄性菌株的性菌毛结合，进入宿主细胞。单链环状DNA首先复制成双链环状DNA，通过反复的滚环复制，产生大量（+）链环状DNA，包装成有侵染活力的噬菌体，从宿主细胞释放出来。这一过程只会降低宿主细胞的生长、增殖速度，不会导致宿主细胞的裂解。释放的噬菌体进行另一轮的侵染，在平板上形成模糊的噬菌斑。     2.载体构建   丝状噬菌体的P3蛋白称为少量外壳蛋白，由406个氨基酸组成，在每个噬菌体颗粒表面仅有3~5个拷贝，由基因III编码。该蛋白的C端区域嵌在噬菌体颗粒的外壳上；其N端区域伸出噬菌体表面，可以特异地吸附在雄性菌株的性菌毛上。在将外源DNA片段插入基因III后，噬菌体外壳便带有外源蛋白片段，但外源基因的插入不能破坏原有的阅读框，否则会产生无感染活性的噬菌体。当插入的外源基因较长时，可能干扰PIII的功能。为克服这一问题，可构建含有两个基因III的噬菌体，其中一个作为外源基因的插入点，而另一个产生野生型PIII，执行正常功能；或者直接用噬菌粒作为克隆表达外源基因的载体，利用辅助噬菌体超感染，得到野生型与融合蛋白混合表达的噬菌体。这样得到的噬菌体颗粒表面一般带有2~3个分子的野生型P3蛋白和一个P3-外源蛋白（肽）融合蛋白。由于一个噬菌体上面只带有一分子的外源蛋白表达产物，利用这个系统筛选出来的蛋白具有较高的亲和力。P8蛋白是丝状噬菌体颗粒的主要外壳蛋白，由基因VIII编码，在每个噬菌体颗粒上大约2700拷贝。利用P8融合蛋白也可以表达外源基因，在组装出来的噬菌体颗粒上携带有数以千计的融合蛋白分子。利用这一系统一般只能筛选低亲和力的蛋白。