谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定
关键词: 谷物种子 萌发 淀粉酶 活力测定来源: 互联网
几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用;其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖;β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料,测定其中α-淀粉酶和β-淀粉活性的差异。 【原理】 两种淀粉酶具有不同理化特性,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;β-淀酶不耐热,在70℃下15min则被钝化。据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 【仪器与用具】 分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;具塞刻度试管(25ml×13);刻度吸管(1ml,2ml,5ml各1支);容量瓶(50ml×2)。 【试剂】 麦芽糖标准液(1mg/ml):称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100ml; DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸):精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20ml 12mol/L NaOH溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞,勿使CO2 进入。若溶液混浊可过滤后使用; 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液: A液(0.1mol/L柠檬酸)—称取分析纯柠檬酸21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L; B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L; 取A液55ml与B液145ml混匀,即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液; 1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 【方法】 1.酶液提取:称取25℃下萌发3~4天的小麦种子1.0g(芽长1.0~1.5cm),置研钵中,加少量石英砂和2ml蒸馏水,研磨成匀浆后转入离心管中,用7ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取15~20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。然后在3000rpm转速下离心10min,将上清液倒入50ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml,放入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀分酶稀释液。 2.麦芽糖标准曲线制作:取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表33-1加入试剂。 表33-1 制作麦芽糖标准曲线配方表
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