相关专题 ELISA免疫实验技术

1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌(Hp)之后，Hp与胃炎、消化性溃疡的相关性引起人们极大的兴趣。人们推测其可能成为这类疾病的致病因素之一。许多研究者正进一步探索其致病机理，并从不同角度寻找快速、可靠的检测方法。迄今为止，检测Hp的方法包括组织标本培养，切片染色，细菌直接涂片染色，快速尿素酶测定及13C尿素呼吸试验和14C尿素呼吸试验等。除尿素呼吸试验外其余方法均需通过胃镜检查才能完成，鉴于取材困难，进一步寻找检测Hp感染的免疫学 方不进非常必要的。国外有人用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测临床病人血清中有Hp抗体报道，国内尚未有这方面研究报告。本文报道建立一种检测人体抗Hp抗体的ELISA的实验结果及与细菌培养法和尿素酶测定法对比检测结果，研究证明本法特异、敏感、适用于大量标本普查和及时判断治疗反应，现将结果报告如下。

1　材料和方法

1.1　材料

①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三厂产品。②酶联板离心篮：根据40孔酶联板本实验室自行设计制成。③DG—Ⅰ型酶联免疫检测仪：南京华东电子管厂产品。④试剂：过氧化物酶(HRP)，R2=3.2，美国Sigma公司产品。邻苯二胺(OPD)：上海白鹤化工厂产品，按文献配制。包被液：取碳酸钠1.59g加碳酸氢钠2.93g，蒸馏水1000ml配成。洗涤液：以上未加吐温—20的洗涤液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液：5%小牛血清。戊二醛固定液：25%戊二醛液，100ml装，Kochligh进口分装，用时稀释成0.25%戊二醛固定液。终止液：2NH2SO4。⑤抗原 的制备：将澳大利亚皇家佩思医院的Hp标准菌株(NCTC11638)及从胃镜检查患者胃粘膜活检标本分离出的Hp菌株分别接种于心脑血平板，37℃培养5d后取菌落作生化与血清学鉴定(自制兔抗Hp抗体)，然后取单个菌落移种于另一血平板，继续培养3d，经鉴定后将其大量增殖培养，3d后将菌苔刮下，置生理盐水中制成菌液，加福尔马林固定(0.1%～0.3%)，4℃过夜，3000r/nin离心30min，沉淀3次，将最后1次沉淀悬于少量PBS液内，用比浊管没出细菌浓度，制成含菌3×109ml，置冰箱冰冻，反复冻融3次，经显微镜检查无菌体存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，-20℃保存备用。⑥临床血清标本：采自胃镜检查患者，随机采取1988年8～10月胃镜检查病人共38人，抽静脉血2ml，分离血清贮存-20℃备用。⑦阴性对照血清，进行ELISA测定，取其平均OD值作对照。⑧酶标羊抗人IgG结合物(SAHIgG—HRP)的制备：按过碘酸盐改良法，略加改进标记制成酶标抗体。即HRP8.0ml，22℃较搅20min。加乙二醇6滴，继续搅拌5min，对pH4.2，0.001mol/L醋酸盐缓冲液(用2molHC1调pH)透析过夜，中间换水4次，加羊抗人IgG(上海生物制品研究所产品)14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸盐缓冲液，使pH升到9.0～9.5，室温较搅2h，加硼氢化钠(4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，对pH7.2，0.01molPB-0.4molNaCl缓冲液在4℃透析平衡。换水4次，收取透析袋内结合物，以50%饱和度硫酸铵溶液盐析去除游离酶后，测定精制结合物，E/P克分子比值合格后，将结合物小瓶分装置-20℃保存，备用。⑨尿素酶测定法和Hp的分离培养法参考文献进行。

1.2　方法

并稍加改进，即：抗原包被微量滴定板：用包被液将抗原按2×108亿/ml(含蛋白8.6μg)稀释后，每孔加100μ，离心篮离心20min2000r/min后，倒去孔内液体，然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗涤液洗3次(每次3min)，加5%小牛血清液，200ml/孔，经37℃30min封板后倒去孔内液体。每孔加待检血清(1：100稀释)100ml，37℃保温1h后，如上洗涤3次，同时做阴性对照孔和空白孔。之后于各孔内加和新鲜稀释的酶标羊抗人IgG结合物100ml，37℃保温半小时，于各孔中加入2NH2SO450μl终止反应后，于酶联测定仪以波长490nm测定OD值，将测得标本OD值(P)与阴性对照OD值(N)比(P/N)，若P/N比大于或等于2.0为阳性。