125I同位素标记单克隆抗体方法
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125I标记单克隆 抗体技术
同位素标记是一种重要的抗体标记技术,牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学 诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外,还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。
(一) 原理
氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠,在水溶液中生成次氯酸,为一种温和氧化剂,当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中,可将I2氧化为I+并结合到氨基酸上。如标记条件温和,标记后的McAb仍具有良好的结合活性,通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原 的含量。
(二) 方法
在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg/100μl, 再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液 再加入10μl(含1mCi)125I
↓
加入10μl氯胺-T(5mg/ml溶于0.05M 磷酸盐缓冲液),孵育时间不超过30秒
↓
加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg/ml溶于 0.05M磷酸缓冲液 )
↓
加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M 磷酸缓冲液+4%牛血清白蛋白)
↓
用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I 用4%BSA PBS洗脱
↓
分部收集,0.5ml/管
每管取5μl进行γ计数,计算标记抗体的比活性和标记率
结合于McAb125I放射性强度(cpm) 标记率(%)=─────────────────── 总放射性强度(cpm)
结合于某一管McAb上的放射性强度 比活性(μCi/μgMcAb)=──────────────── 某一管McAb总量
(三) 试剂器材
1. 纯化后的McAb
2. 0.05M磷酸缓冲液,氯胺桾,偏重亚硫酸钠,KI,BSA
3. 125I
4. 有通风装置的超净台,γ计数仪
5. PD10柱(Sephadex G25)
(四) 注意事项
1. 严防同位素污染,工作人员必须穿着工作衣,戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。
2. 如标记细胞因子、激素等,应选用更温和的标记方法,使保持更好的生物学活性。
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