手上有篇关于lncRNA研究的cell文章，一位兄弟要求我分析下。刚从网上把全文搞下来了，看了下，思路清晰，没有啥需要另外需要学习的内容，应该花不了多少时间用来分析，老毛病就犯了。放到一边去了，先歇歇。今天是周末，看了4份项目，休息下总可以吧。不过，休息的时候看到QQ群上大家对过表达的问题在纠结。想想，分析高分文章，高大上，对大家是有帮助。但对于这些工具的了解，其实也不可小视。手就痒了。

对于研究，其实工具很重要。古语云“工欲善其事，必先利其器”。意思应该中国人都懂吧，除了“香蕉”外（不知道香蕉啥意思？外黄内白）。基因的操作，其实就两个方向，overexpress，和knockdown（程度大点就是knockout，不是季博卖弄英文，这里用英文表述得更清晰些）。

Knockdown今天不讨论。就讨论过表达。过表达，就是把基因上调表达，高于原本天然的表达量。方法，1、外源构建目的基因的CDS区，使用外源启动子表达外源构建的目的基因。这个是最常用的方法，今天就讨论这个。2、上调目的基因的激活型转录因子，从而使得基因上调表达。

怎么上调目的基因的激活型转录因子呢。一个是参考1中的外源构建。一个是用药物刺激（这里的药物可以是化合物，也可以是蛋白等等。比如免疫中常用的LPS也算一个。这次刺激可以是上调基因，其实也可以用来抑制。）。

前面比较热的TALEN技术，大家了解比较多的是用来编辑DNA，其实也可以用来上调基因，把TALE后面不要接DNA酶，接转录因子激活元件，且序列让他识别启动子区。那么就做成人工的转录激活因子了。

Sigh，又开始扯了。还是回到我们的主题吧。外源构建目的基因。其实，这个工具，一开始，只需要考虑两个地方。1、什么启动子。2、基因CDS区。

一、先说启动子。这个是看过表达工具在什么地方用。是原核表达呢，还是真核表达，表达的环境是什么物种。是否需要受诱导。等等。要是不需要表达，T载体就OK了。这里说几个事情，季博以前也弱过（现在其实也很弱）。

啥事呢，在microRNA刚兴起的时候，季博搞不懂用啥启动子来研究的。就问国外的一个教授，教授回答，“与常规过表达有区别吗？”再问：“常规是蛋白编码基因，需要翻译的，microRNA不需要翻译，没有特殊要求吗？”答：“啊，你认为基因表达的过程中，翻译过程会影响转录过程？”

额，不知道，至少现在没有人说过。意思是啥呢，基因表达的两个过程，转录和翻译。启动子只是把后面的片段转录出来，后续的翻译过程启动子控制不了。（有人不了解？跟本科生借本遗传学仔细复习下。）

有人需要组织特异表达基因，这个在哪里控制呢，就是启动子。使用组织特异的启动子就OK了。其实组织特异的敲除也是使用这个原理，把CRE酶放在组织特异的启动子后面就OK了。（CRE loxp系统，不清楚的度下吧。季博就不多扯了。避免有人扔砖头）。

还有就是可诱导，使用可诱导启动子。比如teton启动子。

所以，根据研究目的的不同，寻找合适的启动子。这些启动子，基本上都有相应商业化的载体。如果没有，就自己改建吧。

二、启动子确定了，下面就是基因了。很多人说，这个简单呀。到NCBI上查下，不就OK了吗。是的呀。不过还是有很多细节需要注意的。

多转录本。一个基因如果有多个转录本，那么我做哪个呢。季博也不知道，前面有个兄弟给了个很好的方法，用不同转录本的NM号及研究的内容到NCBI上查，看哪个NM号文章最多，就用哪个。虽然这个方法跟那位兄弟一样比较粗暴，但确实是个好办法（希望老徐看不见这段，哈哈）。当然，如果你知道你的研究方向，别人用的是哪个。哪怕文章少，也得用。

特殊定位蛋白。比如，分泌蛋白。需要有分泌肽。如果研究其功能是分泌出来行使的呢，还是在细胞内行使的。可以把他的分泌肽去掉，看功能。

注意，这个研究方案建议做分泌蛋白和其他特殊定位蛋白的筒子们都做做。把研究做得越细，越有水平。（另外，分泌蛋白，不是说细胞内就没有了，其实蛋白表达都在细胞内进行，细胞内都有的。）

说了这么多，那么问题来了，是不是启动子确定了，CDS也确定了。就OK了呢。

如果OK，季博就不用写这个日志了。以前带师弟师妹，帮别人分析问题，大道至简，对于过表达构建，季博就抓两个地方，1、构建序列正确。2、外源tag抗体检测有外源条带。（季博其实比较笨，老师说了，笨鸟先飞，所以季博就在飞上下功夫。

练就了一手分析的本领。不管啥问题，总能扯出个123的道理来。其实吧，这是吹的。季博的经验是从别人那里获得的。帮人就是帮己。帮10个人，就有10个问题解决的经验了，帮得人越多，经验值越高，就可以打大怪了。）

1、序列。其实，过表达构建，我们能够控制的就是构建的序列。WB发现有问题，第一时间就是看测序结果中，序列是否OK。如果OK。再往下分析。

2、外源tag抗体检测表达。为啥用外源tag抗体呢，因为这些商业化的抗体都是经过大家实践验证的。出来就是出来，不出来就是不出来，不会参入其他原因。

正是因为这一点，验证一个蛋白的目的抗体是否OK，就用一个带有外源tag的蛋白来做WB。外源tag抗体和目的抗体同时做WB，如果条带一致，说明目的抗体OK。如果不一致，说明目的抗体有问题。

在WB中，出现过啥问题。A、不表达。B、大小不对。C、定位不对。

A、不表达。这个比较少，但遇到就很头大。明明序列是正确的，载体也是OK的。为啥不表达呢。为了这个问题，当年季博查了不少文献。大家都知道，真核基因，转录后翻译，是从ATG开始（有其他的，非常罕见，不讨论）。但一个基因有好多ATG，到底从哪个开始？

其实，真核基因翻译开始的ATG有两个特点。Kozak序列有多少人知道呀。这段序列是翻译起始ATG前9到10个碱基，在－3，－6，－9有要求，为嘌呤。所以，很多表达载体上，如果是提供ATG的，基本上都有kozak序列在。老外做过表达构建，引物设计时，往往不是从ATG开始，而是再往前一点点，目的就是把基因自己的kozak序列包括进来。

那么问题来了，是不是没有kozak就不行了呢。不要急。还有一个特点，ATG后面如何还是一个G，也就是ATGG，那么这个ATG也可以作为翻译起始位点。但不绝对。有个比例的，这么多年，忘记了。很多基因CDS区，其实都是ATGG，大家去看看。这两个规律是根据蛋白表达基因分析归纳出来的。不是推导的。

B、大小不对。其实，只要1、序列正确。2、外源tag抗体能够检测到条带。季博就认为过表达构建是OK了。B和C的问题，不是构建的事情了，而是需要研究了。大小不对，一般需要考虑是否为修饰，什么修饰，是磷酸化还是糖基化（膜蛋白经常会有）。是否有剪切。

这个就复杂了，以前季博的建议是，看看别人的研究中是否也这样。如果找不到原因。反正序列是正确的，到细胞内发生什么事情，外源会这样，内源也会这样。就直接做功能吧。实在不行，就去做干扰。

C、定位不对。这个一般是考虑构建时GFP放在什么地方。蛋白定位信号一般在N端，所以，外源tag或者GFP等荧光蛋白，一般是构建在蛋白的C端。但有例外。自噬的marker基因LC3，其定位到自噬体膜上，其C端是需要剪切掉，再加上一个分子，才能定位到自噬体膜上。所以，如果把GFP构建到LC3的C端，把细胞饿死了，也不会看到荧光自噬体的出现。

这个地方的考虑，需要在构建前就考虑清楚。季博以前是要求，做课题的人查文献看，确定构建的序列。如果不能确定，那就先做了看。构建的人，不一定知道这些道道。（其他地方不知道如何，复旦这边，一般是师兄师姐带师弟师妹，所以，构建的事情一般是师弟师妹做。

季博当时的主张是，多帮师兄师姐干活，因为，如果遇到问题，他们来解决，就长经验了。等做自己的课题，就少走弯路了。要感谢师兄师姐提供学习的机会。）以前，别人帮忙做构建，季博只要求构建的序列是OK的。如果WB出现异常情况，这个不是构建的人能够解决的。

By 吉凯基因 季国庆 博士