1. 试剂配制

准备工作：

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：

▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5

三水合柠檬酸纳    22.94g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

                                                                                                           

▲10%肌氨酸钠：

肌氨酸钠           10g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。              

                    

▲变性裂解液：                 

0.78M柠檬酸钠    8.25ml

10%肌氨酸钠      12.375ml

异硫氰酸胍        118.05g

加DEPC水定容至  250ml，室温放置备用

                  临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

 

▲ 2M 醋酸钠    PH=4.5

             NaAc・3H2 O        13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

                                                                                                                                                      

▲ 3M醋酸钠     PH=5

            NaAc・3H2 O        20.4g

            加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲    4M LiCL:

                LiCL               24.164g

                    加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用

 

▲0.5M EDTA  PH=8.0

                    EDTA              18.61g

用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用                

    ▲10X  MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):

                  MOPS              41.86g

NaAC・3H2 O        4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

▲    1x  MOPS:

10x  MOPS         30ml

加DEPC水270ml，用时现配。

 

▲4x RNA  Loading  buffer:

                  10x MOPS                 400ul

                  甘油（高压过）            200UL

                  溴酚兰                    10ul

                  甲醛(37%)                 72ul

                  去离子甲酰氨             310ul

                  EDTA(0.5M  PH 8.0)        8ul

                  ErBr(10mg/ml in DEPCH2 O)   70ul

                  在4℃ 可保持3个月

▲    10x PBS

pH=7.4

NaCl    80g

KCl     2g

Na2HPO4   14.4g

KH2PO4    2.4g

定容至     1000ml

▲变性电泳胶：

称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液：

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml

 

2. 动物组织 total RNA 的提取

1．       根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。

2．       将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。

3．       根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。

4．       根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

5．       冰浴10分钟。

6．       4°C，12000g离心20分钟。

7．       小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8．       加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。

9．       4°C，12000g离心20分钟。

10．   根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11．   加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

12．   4°C，12000g离心20分钟。

13．   小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。

14．   4°C，12000g离心20分钟。

15．   弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。

16．   弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17．   取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。

 

表 1

Mg# of tissue	500	800	1000
变性裂解液(ml)	5	8	10
2M NaOAC pH 4 (ml)	0.5	0.8	1
水饱和酚 (mL)	5	8	10
氯仿 (mL)	1	1.6	2
异丙醇(mL)	4	6	8
变性裂解液 (mL)	0.5	0.8	1
异丙醇(mL)	0.5	0.8	1
75% 乙醇(mL)	1	1	1
DEPC-treated H2 0 (mL)	0.5	0.8	1

 

3. 植物组织total RNA的提取

1.      先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2.      将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。

3.      加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

4.      加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。

5.      冰浴10min。4℃，12000g离心10min

6.      小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。

7.      4℃，12000g离心20min。

8.      去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。

9.      4℃，13000rpm离心15min。

10.  用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

11.  4℃，13000rpm离心10min。

12.  取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。

13.  4℃，13000rpm离心15min。

14.  弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。

15.  弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。

16.  用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17.  取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1．  查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2．  将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。

3．室温温育10分钟 。

4．  据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。

5．  4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。

6．  转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。

7．  4ºC,12000g离心10分钟。

8．  去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9．  4ºC，7500g离心5分钟。

10．            去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11．            取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。

表2

组织量	TRIzol Reagent	氯仿	异丙醇	75%乙醇
50~100mg	1ml	0.2ml	1ml	1ml