随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。

　　差别显示PCR是根据绝大多数真核细胞mRNA的3′端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5′-T11MN；同时为扩增出polyA上游500 bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10 bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA类型，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。回收不同组织所特有的差别表达条带中的DNA，再扩增至所需含量，进行Southern blot或Northern blot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。

　　差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可（5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ），这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些RNA的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3′端引物和5′随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点（如Hind III酶切位点），使得5′端引物条数改为8条，长度为13 bp，而3′端引物则由18个碱基组成。这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。有的实验室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端为26 bp，3′端为31 bp，并加上了T3和T7两端的测序引物，由仪器切割差异条带后，再次扩增，并通过荧光标记，用计算机统计出结果。此外，许多学者针对该技术在操作中假阳性高等问题，还从设计对照、提取胞质RNA、更换放射性标记物以及改变PCR反应条件等等方面提出了相应解决方案，以求这一技术得到进一步完善。

　　mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）与示差筛选、扣除杂交相比，具有很多优点：①速度快，较易操作；②由于PCR扩增技术的应用，使得低丰度mRNA的鉴定成为可能，且灵敏度高，③可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。

　　尽管差别显示技术有以上诸多方面的优点，但在实际操作中仍存在一些问题，主要表现在：①出现差别条带太多，假阳性率高达70%左右，重复性差，且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性；②扩增条带分子长度较短，一般在110-450 bp之间。

　　代表性差示分析，充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。将待测cDNA（Tester）和驱动cDNA（Driver）分别用同一种经识别4碱基序列的限制性内切酶切割形成的平均长度为256 bp的cDNA片段代表群，保证了绝大多数遗传信息均能被PCR扩增；分别接上寡聚核苷酸接头（adaptor），并以接头为引物进行PCR扩增，此步将大小不等的DNA片段分离纯化；将接头切除，并只在Tester片断末端接上新接头，然后将Tester与大大过量的Driver混合杂交。Driver过量的目的是使Ｔ群体中特异性序列没有遗漏的可能；复性，补平末端，并以新接头为引物进行PCR扩增，形成的3种杂交体中只有自身退火形成的Tester/Tester两端均能和引物配对，产物双链DNA数量呈指数递增。Tester/Driver杂交体只能是单引物扩增，产物为单链DNA分子，其数量呈线性递增。Driver/ Driver杂和体由于分子两端没有与新引物配对区而无法进行扩增；用Mung Bean Nuclease去除单链DNA分子，差异双链cDNA便完成第一轮富集。实验中使用过量Driver DNA目的是充分使Tester DNA中和Driver DNA序列相同的片段杂交，酶解去除，只有差异双链差异cDNA经PCR几轮循环得以有效富集。

　　（二）抑制性扣除杂交（SSH）

　　如果两处理间存在较大差异，以及某些基因在Tester中存在上调表达（up-regulated expression）时，用RAD方法则达不到预期目的。于是，Diatchenko等于1996年提出了一种可以有效克服基因上调表达所造成不利后果的克隆基因的新方法——抑制性扣除杂交（SSH）。该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。而所谓抑制PCR，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。

　　其具体过程为：

　　①与RAD相同，酶切后得到Tester与Driver样本的平末端cDNA片段；

　　②将Tester cDNA均分两份，分别接上接头1（adaptor 1）和接头2（adaptor 2）。接头设计上，adaptor由一长链（40 nt）和一短链（10 nt）组成的一端是平端的双链DNA片段，长链3′端与cDNA 5′端相连。长链外侧序列（约20 nt）与第一次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第二次引物序列同。此外，接头上含有Ｔ7启动子序列及内切酶识别位点，为以后连接克隆载体和测序提供方便；

　　③用过量的Driver样品分别与两份Tester样品进行第一次扣除杂交，分别得到4种产物。这种不充分杂交使得单链cDNA分子在浓度上基本相同。同时由于Tester cDNA中与Driver cDNA序列相同片段大都形成异源双链分子，使得Tester cDNA中差异表达基因得到第一次富集；

　　④混合两份杂交样品，同时加入新的变性Driver cDNA进行第二次扣除杂交。此次杂交只有第一次杂交后经扣除和丰度均等化的单链Tester cDNA能与Driver cDNA形成双链分子。这一次杂交进一步富集了差异表达的cDNA，并且还形成了两个5′端分别接不同接头的双链分子；

　　⑤5′填平末端，加入根据接头长链序列设计的内、外侧引物进行PCR扩增。第一次PCR是基于其抑制效应，只有两端分别是接头1和接头2的具差别表达的序列片段得以指数扩增。第二次PCR极大提高扩增的特异性，使得差异表达的目的基因片段得到大量富集，并可用于后续的筛选工作。

　　（三）代表性差示分析（RAD）和抑制性扣除杂交（SSH）优缺点分析

　　代表性差示分析（RAD）优点可以概括为以下几个方面：①引物设计十分巧妙；②可重复性好；③假阳性少；④mRNA用量少、特异性高。其缺点为：①Tester组低丰度的分子自身杂交的几率很低，所以被扩增和克隆的几率仍很低；②酶切连接步骤太多，cDNA会损失很多，所以可能漏掉关键基因；③得到的不是cDNA全长而是其酶切片段。

　　SSH自从在克隆基因的实验中采用以来，其优势是非常明显的，主要表现在：①极大降低了假阳性率，由于SSH方法采用两次扣除杂交和两次PCR，保证了该方法具有较高特异性。据有关报道证明SSH方法假阳性率可降至6%；②具高度灵敏性，由于在反应中将丰度不同的单链分子含量归一化，保证了低丰度mRNA检测成功；③SSH法在一次反应中,可同时分离出上百个差异表达的基因,这一点远胜于DDRT-PCR和RAD。而其缺点与RAD类似。