噬神经元的腺病毒载体的构建
实验试剂
腺病毒包装载体PLP1,pLP2(之前),PLP / VSVG
实验设备
Steriflip-GP过滤器(0.22微米)
超离心管17.0mL
实验材料
2.5M氯化钙溶液:36.75克氯化钙,70毫升双蒸H 2 O,通过0.22μm滤膜过滤,体积调制100毫升
2X HEPES缓冲:氯化钠280 mM,50mM肝素钠,1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05)
实验步骤
1.收集预融合的HEK 293T细胞,细胞培养于完全DMEM培养基中(含10%FBS,50 U/ml的青霉素G和50μg/mL链霉素的,pH值7.35)。
2.将收集的浓度为1×106 的HEK 293T细胞接种于直径10cm的培养皿中,加入10mL完全DMEM培养基。漩涡震荡使细胞均匀分布, 37℃培养24h。
4.更换DMEM培养基(10%FBS,10mL),继续孵育于CO 2 培养箱30min。
5.将10µg腺病毒转移载体与10µg包装混合物混合,用无菌ddH2 O稀释质粒至总体积450μL。
6.向质粒中加入50μL 2.5 M氯化钙混匀,然后加入500μl 2xHEPES缓冲液,涡旋。
7.将所有的转染混合物加入(散开)培养板,轻轻震荡,继续培养于5%CO2 培养箱过夜(16h)。
注意:细胞不能达到饱和状态,应该有供细胞分裂生长的空间,因为细胞铺满后培养基的pH值会迅速下降。
9.吸出培养基,加入5mL预热的PBS(-)洗两次细胞,然后加入9.5mL新鲜培养液的DMEM培养基, 5%CO 2 培养箱继续培育,37℃过夜。
11.通过0.22微米的过滤器过滤,清除上清液中的细胞碎片。
12.超速离心浓缩病毒颗粒。4℃,用吊桶式转头离心上清120000xg,1.5h。将2个培养板(约18mL)的上清浓缩于一管。
14.用90μL PBS(-)重悬病毒颗粒。病毒悬浮液,可用于在体外和体内实验:但是,如果需要纯净级的质量,可通过如下步骤纯化病毒。
腺病毒载体的滴度通过HeLa细胞的转染来测定。虽然滴度可以在13步后就可以计算,但为了缩短整个过程我们通常从第3天开始计算。
15.将 1×105 的的HeLa细胞接种于含1mLDMEM培养基(10%FBS)的12孔板,添加聚凝胺至浓度为6 µg/ml。在5%CO2 培养箱孵育,37℃过夜。
16.用PBS 10倍梯度稀释的病毒(稀释从10 -3 到10 -6 )。实际测试的范围将取决于病毒制剂的浓度。17.将每个梯度稀释的病毒加入单层生长的HeLa细胞,轻轻摇匀, 337℃培养。
18.细胞再生长3天(感染后总88h),绿色荧光蛋白染色后48h可见。然而,这个时间根据滴定用腺病毒载体和细胞株不同而有所不同。