实验原理

亚适剂量抗IgM抗体对B淋巴细胞的刺激较弱，当加人IL-4时，B淋巴细胞对亚适剂量抗IgM抗体刺激表现出明显的DNA合成增加，3 H-TdR掺人量与IL-4含量相关。

实验步骤

1. 小鼠脾脏B细胞悬液的制备    1) 取BALB／c或C57BL／6小鼠，常规方法分离脾脏淋巴细胞。用Hanks液洗2次；再用10％NBS-IMDM培养液调整细胞浓度为1X107 ～2X107 ／mL。    2) 去除粘附细胞：将上述脾细胞悬液置24孔培养板，每孔1～1．5mL，置37℃，5％CO2 温箱中培养1h；将细胞悬液移至另外培养孔内，继续培养1h，收集非粘附脾细胞；亦可通过SephadexG-10柱去除粘附细胞。    3) 去除T细胞：调整细胞浓度至5X107 ／mL，按1：40(V／V)加入抗小鼠T细胞血清或抗Thy-1，2McAb，置4~C 30min后，按1：15(V／V)加入新鲜豚鼠混合血清，充分混匀后温育1h；离心弃上清，用无血清培养液悬浮细胞。此时T细胞已死亡破碎，通过淋巴细胞分层液，低速离心予以去除。    4) B细胞的相对纯化：用淋巴细胞分层液500—800r／min离心6—8min，将上述细胞悬液再次纯化；用Hanks液洗1—2次，调整细胞浓度至1X106 —2X106 ／mL。 2. 诱生上清IL-4含量的测定    1) 将上述B细胞悬液加入96孔培养板，100~tL／孔，分别加入待测IL-4诱生上清或不同量标准品rlL-4，其浓度为每毫升0．5U、1U、2U、3U、4U、5U、6U，各组均设3复孔。    2) 加亚适剂量抗IgM抗体，一般终浓度0．5％(V／V)为抗IgM的亚适剂量，也可在实验前自行测定。    3) 常规培养48～72h，结束前8-16h加入3 H-TdR，收获细胞测定cpm值；以标准品cpm值绘制标准曲线，从标准曲线上查出IL-4活性。

注意事项

1. B细胞纯度直接影响结果，B细胞悬液中若含有T细胞或死亡T细胞及其碎片，可影响试验结果。因此有人主张用Percoll不连续密度梯度离心，去除死细胞及碎片，可得到较高纯度的B细胞悬液。 2. 纯化B细胞悬液时，应尽量缩短操作时间，减少不利因素，保证细胞活力，使实验结果较稳定，重现性好。 3. 诱生细胞上清收获时间必须控制在30h左右。时间过长，上清中IL-4含量会降低。