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M-MLV第一链cDNA合成试剂盒-技术手册

关键词: cdna 合成试剂盒 手册来源: 互联网

M-MLV第一链cDNA合成试剂盒-技术手册

一、 试剂盒组成

Components SK2027 SK2028
5×M-MLV Reaction Buffer 100µl 250µl
dNTP Mix,10mmol/L 25µl 55µl
Oligo-p(dT)18 Primer, 0.5µg/µl 25µl 55µl
Random Primer p(dN)9 , 0.2µg/µl 25µl 55µl
RNase Inhibitor (a) , 40U/µl 20µl 50µl
M-MLV Reverse Transcriptase (b) (200U/µl) 4000U 10000U
RNase-free ddH2 O 1ml 1ml
Protocol 1 1

(a) 1U RNase Inhibitor定义为能够抑制5ng RNase 50%活性的蛋白质量。避免反复冻融,使用时保持冰 浴。

(b) 1U M-MLV RT在37℃10分钟能将1nmol的脱氧核糖核酸变成为DE81可吸附形式。避免反复冻融,使用时保持冰浴。

(c) 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。

(d) 避免多次反复冻融RNA ,使RNA 保持在冰浴中处融化状态。

(e) 所有准备工作和实验步骤按《RNA 操作指南》操作。

二、试剂盒说明

1.试剂盒依赖逆转录酶(M-MLV RT),以RNA 为模板获得全长的第一链cDNA,其起始位点由所用引物所决定:

(1)随机九合引物[Random Primer p(dN)9 ]在RNA 模板上没有特异性结合位点,所有RNA 都可以做为第一链cDNA合成的模板;

(2) Oligo(dT)18 与poly(A)+ mRNA 的3’-末端互补,只有poly(A)+ mRNA 可作为cDNA合成的模板;

(3) 采用序列特异性引物以其结合位点为起始位点。

2.当第一链cDNA合成条件与PCR的条件能够兼容时,则本试剂盒的第一链cDNA合成产物可直接加入PCR反应混合物中进行反应。

3.第一链cDNA合成产物同样可经过处理后作为第二链合成的模板, 合成含各种标记的cDNA可以作为杂交实验的探针。

三、操作流程

1.在冰浴的试管中加入如下反应混合物:

(1) 模板RNA :

总RNA 1-5µg
或poly(A)+ mRNA 0.1-0.5µg
或特异性RNA 0.01pg-0.5µg

(2) 引物:

Oligo(dT)18 (0.5µg/µl) 1µl
或随机九合引物(0.2µg/µl) 1µl
或序列特异性引物 20pmol

(3) 无RNA 酶去离子水(RNase-free ddH2 O):定容至13µl。

2.轻轻混匀后,在70℃水浴5分钟后,冰浴30秒。

3.将试管冰浴,再加入如下组分:

5×Reaction Buffer 4µl
RNase Inhibitor (40U/µl) 1µl
dNTP Mix(10mmol/L) 1µl

4.轻轻混匀后离心3~5秒。加入1µl M-MLV RT(200U/µl),终体积为20µl。

6.反应混合物37℃水浴40~60分钟(如果采用随机九合引物则预先在25℃温育10分钟,然后37℃水浴40~60分钟)。

7.在70℃加热10分钟结束反应,置冰上进行后续实验或冷冻保存。

四、后续实验

1.第一链cDNA的合成产物能够直接用于PCR扩增。

2.第一链cDNA的合成产物能够直接用于第二链合成必须调适为能够使用下列产品:

DNA聚合酶

T4 DNA连接酶

核糖核酸酶H

S1核酸酶

五、RNA 操作指南

RNA 抽提纯化是分子生物学研究的基本工作内容。但是由于RNA 酶(RNase)的广泛存在和难以灭活的特性,使RNA 的抽提纯化和后续工作特别困难。

虽然Trizol试剂和各类RNA 抽提纯化试剂盒的广泛应用使RNA 抽提和纯化变得简单易行,但是涉及RNA 的工作仍然是分子生物学研究中最让人感到棘手的。为了保证您的工作顺利进行,请仔细阅读本指南,相信它能帮助您解决常见的问题。

RNA 相关工作中的主要问题是防止RNase的污染。RNase无处不在,在实验操作的任何一步,任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNase的污染,从而导致整个实验的失败。因此,严格控制实验条件,避免任何可能的污染,是保证实验成功的关键。

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