随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现。尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。

如不对称 PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具。

但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用。

1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交叉污 染情况，以及传染源的调查等。由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用。

SSCP的原理及特点

日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同。

因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开。作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。

在随后的研究中，作者又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性。

其基本过程是:

①PCR扩增靶DNA;

②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；

③将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要。

但它也有不足之处。例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；

另外，由 于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。尽管如此该 方法和其他方法相比仍有较高的检测率。

首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变。Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发 现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。

另外，SSCP方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步 提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。

SSCP的不断改进

SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果。这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化。

最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达90%以上。

另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。但该方法增加了一个反转录过程；还需要一个较 长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度。

为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂 交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率。

Het法是用 探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。

对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便。

PCR-SSCP的实验操作

在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)

1Kb～700b 3.5

700b～500b 5

500b～200b 8

200b 12

在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾)。

1、制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固。然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用。

2、电泳

取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳。开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染。

3、银染法

将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色。