DNA连接酶(DNA ligase)介绍
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA
连接酶催化成磷酸二酯键。
常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。
T4DNA连接酶作用机制：
T4连接酶作用分三步：
(1) T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。
(2) 酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
(3) 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.
但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。T4 DNA
连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3 羟基和5
磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA
连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA。
T4DNA连接酶连接要求和结果
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外源DNA末端性质 |
连接要求 |
连接结果 |
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不对称粘性末端 |
两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 |
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。 |
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对称性粘性末端 |
线形载体DNA常需 磷酸酶脱磷处理 |
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源 DNA会以两个方向插入到载体中。 |
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平端
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要求高浓度的DNA和连接酶 |
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。 |
1. 一般性质： 大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与 NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭 DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA- DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。
