杂交瘤细胞的制作方法
1） 瘤细胞培养（无特殊要求）
骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长， 如附着性生长的细胞多时， 用吸管轻轻吹打或轻轻 叩击培养容器即可分离下来。 通常要维持细胞于指数生长期 （细胞培养时间为 15~20 小时） ， 5 6 每 3~5 天取细胞 0.2~1ml 移入到 10ml 新培养液中， 其最大细胞密度不能超过 5×10 ~10 /ml。 一般使用含有高糖的 DMEM 培养液，并补加有 pH 的稳定剂 HEPES。
2）免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫小鼠：取 6~8 周龄 Balb/C 雌鼠，基础免疫 2 周，静脉再加强免疫一次，3~5 天后用于融合。
脾细胞制备： 1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用 5ml 无血清培养液冲洗一次。
3．把脾脏置于已消毒的 90~100 目不锈钢网或尼龙纱网中。
4．在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通 过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入 3 ml 无血清培养液，反复抽吸数次方 法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。
5．把细胞悬液注入 50ml 离心管中，加 10~20ml 培养液，轻轻吹打数次，室温中置 5 分钟。
6．离心（800~1000 转/分）计数，备用。
3）饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞
饲细胞的制备：
小鼠腹腔细胞制备方法：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．切开腹部皮肤剥向两侧，暴露出腹壁。
3．用无菌 7 号针头注射器，吸取 3ml 无血清培养液。
4．用小镊夹起腹壁，注入 3ml 无血清培养液，用手反复轻轻揉腹壁，再反复抽吸 3~5 次。
5．收集末次吸得的细胞，注入 50ml 的离心管中，再加 20ml 无血清培养液，用吸管漂洗一 次。
6．离心，去上清，用含血清培养基调节细胞浓度为 2×105/ml，接种入培养板中，24 孔板 每孔加 0.1ml。
4）细胞融合
HAT 培养基的制备 [贮备液成分]100× 次黄嘌呤（Hypoxanthine: H） 胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 氨基喋呤（Amiropterin: A） [HT 贮备液制备 贮备液制备]
1．称取 136.1 mg H，38.8 mg T。
2．依次溶解在 100ml 双蒸水中，H 难溶，可加温 50~80℃促溶。
3．用 0.22 微米滤膜滤过除菌，每瓶分装 2~5ml，-20℃冰箱贮存。
[A 贮备液制备 贮备液制备]
1．称取 17.6mg A 到 90ml 双蒸水中。
2．滴加 1M NaOH 溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量 1M HCl 溶液，恢复 pH 在 7.0 左右。 3．补足双蒸水至最终体积 100ml。
4．0.22 微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。使用时，每 100ml 培养液（含血清）加 1ml HT 贮备液和 1ml A 贮备液。 1.0×10-2 M 1.6×10-3 M 4.0×10-5 M PEG（诱导剂）的制备（30%~50%）
1．取分子量 1000 的 PEG 高压蒸气灭菌（6.8 公斤，15 分钟）
2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中温浴。
3．取无血清培养液 37℃水浴中温浴（单独）
4．配 40%浓度时，用刻度吸管吸 0.4ml PEG 和 0.6ml 无血清培养液混合、37℃水中温育备 用。
细胞准备
1．收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗 3 次（37℃） ，计数活力细胞（不少于 90%） 。
2．收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗 3 次（37℃） ，并计细胞数和测定活力细胞。
3．按 1：5 或 1：10 混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上 清。
融合方法一：
1．将 1ml 40%的 PEG 液一滴滴加入到细胞团中，在 60 秒内加完，同时并不断轻微转动离 心管或用手指轻弹离心管。
2．在不断转动离心管中加 1ml 无血清培养液，60 秒钟内加完。
3．于 5 分钟内慢慢加完 20ml 无血清培养基。此时细胞对机械损伤非常敏感。
4．离心（800 转/分，8 分钟） ，去上清，用完全培养液 10ml 悬浮，轻轻混匀。
5．取 96 孔板，每孔加 50 微升。
6．取等体积细胞悬液，向另一 96 孔板中加 50 微升。
7．送入 5%CO2 温箱中 37℃培养，24 小时后更换成 HAT 选择性培养液。
方法二：
1．加 0.2ml 43%的 PEG 于离心管中。
2．用预先消毒的细玻璃针伸入管中轻轻搅动细胞团。
3．室温中置 2 分钟。
4．加入 10ml 完全培养液。
5．800 转/分离心 5 分钟。
6． 2 倍 HAT 培养液培养悬浮细胞， 24 孔板， 用 取 每孔中加 0.5ml， 96 孔板每孔中加 0.1ml。 另 7．5%CO2 温箱，37℃，一周后第一次更换培养液，培养板中预先接种有饲养细胞，加 2× HAT 选择培养液与原等量培养液混合后，即成为 1×的 HAT 培养基。
融合后细胞培养
1．融合后 7~10 天用 HAT 培养液变量换液，以后每隔 2~3 天半量换液一次。
2．两周后可改用 HT 培养液半量换液，或仍用 HAT 培养液。
3．2~3 周后出现杂交细胞集落，细胞个大，圆且透明。
4．待集落增殖生长至 1/3 孔时，应进行抗体检测。
克隆化培养 [软琼脂培养]
1．称 1g 琼脂粉，加入到 100ml 双蒸水中，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。
2．使用前，1%的琼脂和 2×的 DMEM 培养液在 45℃水浴中分别温浴。
3．二者等体积混合后，立即加入 1.5×107 小鼠脾细胞，混匀。
4．立即到入平皿中，每平皿（直径 10cm）加 10ml，室温中置 15 分钟。
5．另取杂交瘤细胞悬液和 0.5%琼脂等体积混合（0.25%琼脂） ，加 2ml 到预先铺有底层琼脂 的瓶皿内。
6．CO2 温箱培养。
7．10~15 天后，有细胞集落形成，适时移入 24 孔培养板中扩大培养。如用琼脂糖，底层浓 度为 0.6%，上层为 0.3%琼脂。
[有限稀释法]
1．制备有饲养细胞底层的细胞培养板。
2．收集细胞、计数阳性培养细胞。
3．细胞悬液调至 5~10 个细胞/ml。
4．96 孔板中每孔加 0.1ml。
5．CO2 温箱培养一周后，半量换液，继续培养。
6．适时检测每孔培养上清，挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限稀释，直至确信孔中细 胞为单克隆为止。
7．进行扩大培养。
5）抗体的检测 ） 常用方法：免疫荧光试验、放射免疫试验（RIA） ，酶联免疫吸附试验（ELISA）等。 胞的筛选 ELISA法。首次检测时间在细胞融合后10天左右进行。
ELISA法所需试剂配置
包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至 1000ml
洗涤缓冲液(pH7.4 0.15M PBS):
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tween-20 0.05% 0.5ml
加蒸馏水至 1000ml 包被抗原：pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS）稀释抗原，加入到酶标板中，100μL/孔，37℃ 2小时或4℃过夜。甩干，洗涤3次，3分钟/次。
封闭（血清或脱脂奶粉）：此步有时用，有时不用。
加被检样品（一抗），100μL/孔，37℃ 半小时，甩干，洗涤3次，3分钟/次。
加酶标抗体（二抗），100μL/孔，37℃ 半小时，甩干，洗涤3次，3分钟/次。
显色： 5ml的显色A液,5ml的显色B液，100μL/孔，37 ℃反应10～20分钟。
终止反应：加2M H2SO4，50μL/孔。
结果判定。肉眼或用酶标仪在450nm波长下测定OD值。
本实验室目前采用洗板机进行洗涤。
