细胞介导细胞毒作用检测法4：时间分辩荧光分析法
时间分辩荧光分析法
1）铕荧光检测法
标记靶细胞
1．EuCl3的制备：称取58.08mg Eu2O3，用少量1N HCl搅拌至溶解，再用1N NaOH调节pH至4.0。加双蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存备用。
2．用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×106/ml，加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖，置冰浴中20分钟，其间摇晃数次。
3．加入30μl 100mmol/L CaCl2溶液终止反应5分钟。
4．用含2mmol/L CaCl2的RPMI-1640培养液洗涤细胞5次。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×104/ml。
检测方法
1．在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞悬液，每孔加100μl。
2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl 0.5％ Triton X-100。每个实验置三个复孔。
3．置37℃ 5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养3小时。
4．从每孔吸出20μl上清液，对应加入另一块96孔酶标板中，向第二块板每孔加200μl增强液。室温中混合5分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做EuCl3的标准曲线：用0.05mol/L pH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度
5．特异性杀伤活性计算：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％
2）用时间分辩荧光检测法同时检测NK细胞对三种靶细胞的细胞毒性
标记靶细胞
1．取107靶细胞，用洗涤液（含93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl和2mmol/L MgCl2的50mmol/L pH7.4 Hepes，双蒸水配制）洗涤一次。小心吸去上清液，用1ml标记液（洗涤液中加0.5mg/ml磷酸葡聚糖和0.06mmol/L Eu3+或2mmol/L Sm3+或0.2mol/L Tb3+，以及比镧系离子浓度高5倍的DTPA）悬浮细胞。将细胞悬液置冰上20分钟，每3分钟上下吹打1次。
2．加入2ml终止液（洗涤液中加2mmol/L CaCl2和10mmol/L葡萄糖），终止标记反应并使细胞膜上的孔隙封闭。5分钟后用终止液洗涤3次，用细胞培养液洗涤3次，每次洗涤时离心500×g 10分钟。
3．用细胞培养液将细胞配成1.2×105/ml或5×104/ml备用。
NK细胞毒试验
1．取96孔圆底细胞培养板，每孔加3中标记靶细胞悬液各0.033ml和0.1ml不同浓度的NK细胞，使效靶比从100：1到6：1。自发释放对照中不加效应细胞，只加0.1ml细胞培养液。最大释放对照中不加效应细胞，加0.1ml 1％Triton X-100。每种处理重复3孔。
2．在37℃ 5％ CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
3．离心1 500×g 10分钟。每孔取20μl上清液对应转移到另一块96孔平底细胞培养板中。每孔加200μl Delfia增强液，用下表的条件测定Eu3+和Sm3＋的荧光强度。
循环时间（ms） | 滞留时间（ms） | 计数时间（ms） | 发射波长（nm） | |
Eu3＋ | 1 | 0.4 | 0.4 | 613 |
Sm3＋ | 1 | 0.05 | 0.1 | 643 |
Tb3＋ | 2 | 0.5 | 1.4 | 545 |
4．用下式计算特异性杀伤活性：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％
3）用荧光增强配体标记的靶细胞检测CMC活性
1．标记靶细胞：在1×106/ml K562细胞中加入BA-TDA到10μmol/L，37℃标记30分钟。用洗涤液（137mmol/L NaCl，4.2mmol/L NaHCO3，5mmol/L KCl，0.44mmol/L KH2PO4，1.2mmol/L TES pH7.4）洗涤细胞5次。用细胞培养液将细胞配成5×104/ml。
2．取96孔圆底细胞培养板，每孔加0.1ml标记靶细胞悬液和0.1ml不同浓度的NK细胞，使效靶比从100：1到6：1。自发释放对照中不加效应细胞，只加0.1ml细胞培养液；最大释放对照中不加效应细胞，加0.1ml 1％ Triton X-100。每种处理重复3孔。
3．在37℃ 5％ CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4．离心1500×g 10分钟。每孔取20μl上清液对应转移到另一块96孔平底细胞培养板中。第二块板每孔加180μl Eu3＋溶液，摇晃5分钟后用时间分辩荧光分析仪检测荧光强度。计算杀伤活性。
