目的基因的亚克隆-2
2. 连接产物的转化
⑴ 取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；
⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；
⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；
⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养 12-16hr。
五、重组子的筛选
根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
六、注意事项
目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。
2. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。
2. 连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。
3. 制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。
5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。
聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为 93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：
(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；
(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；
(3) 从cDNA中克隆某些基因；
(4) 生成大量DNA以进行序列测定；
(5) 突变的分析；
(6) 染色体步移；
(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备
DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶 （2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视 PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
