目的基因的亚克隆（subcloning）-2
四、连接产物的转化
1.感受态细胞的制备
⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。
⑵ 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。
⑶ 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为 0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）
⑷ 将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。
⑸ 4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。
⑹ 以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。
注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。
2. 连接产物的转化
⑴ 取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；
⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；
⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；
⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养 12-16hr。
五、重组子的筛选
根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由
α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源插入到质粒的多位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
六、注意事项
1. 目的片段制备、回收、纯化时，应避免外来污染。
2. 不同厂家生产的T4 连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质分子连接的T4
连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。
2. 连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组也得到增殖。
3. 制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。
5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。
