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pcr原始曲线和扩增曲线区别

2023.1.17

扩增曲线可以粗略地判断扩增效率。SYBR Green的双delta Ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致。如果不一致,需要对公式进行修正,部分qPCR仪的配套软件可以做到,直接输入每对引物的扩增效率。但无论如何,保证高扩增效率是实验成功的关键。

如果扩增效率一致,不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位移,其倾斜程度基本一致。而如下图一样,一条比较“陡”,另一条比较“平”,那么意味着扩增效率不一致。有可能是引物效率不一,或者个别样品、反应孔存在抑制PCR的污染等。

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溶解曲线分析

可以用来确定不同的反应产物,包括非特异性产物。扩增反应完成后,通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线,随着反应中双链DNA变性,荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低,用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图,在扩增产物的溶解温度上有一特征峰,用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开,因为它们在不同的温度溶解。


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