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怎么通过Q-PCR的扩增曲线和溶解曲线来分析结果

2021.8.12

1、扩增曲线(如果做双ΔCT法):

(1)扩增曲线必须是S型,有明显的四个时期,且复孔的CT值尽量一致,相差不要超过0.5个CT值(上限是1个CT值);

(2)同一个基因在不同浓度的相同模板下扩增,其相差的CT值为相差浓度倍数的2次开方。当然这是理论值;另外阴性对照不能有扩增(40个循环以后出CT值属正常现象,也可算作没有扩增)。

2、溶解曲线:

(1)溶解曲线是判断扩增产物是否单一的曲线,顾名思义,其跟模板(或其浓度)没有关系,扩增什么基因就应该有其相对应的溶解曲线;

(2)一般SYBR法的目的基因在80~90℃之间;

(3)出现其他峰就该考虑是否为引物二聚体(一般为60~75℃之间)视引物长度而定,而基因组DNA污染的峰会在90℃以后。出现引物二聚体可能是引物设计、引物加量等原因所致;

(4)基因组DNA那么考虑设计跨内含子引物或者实验之前做gDNA的消除工作。而阴性对照有目的峰那可能就是模板污染,注意实验操作等避免模板污染。

3、溶解曲线是为了验证扩增产物特异性的,要是溶解曲线是单峰说明产物只有一条,结果较好;要是双峰说明产物不特异,可能存在引物二聚体或非特异性扩增,有可能引物设计有问题。


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