影响分光光度计透射比示值偏差的原因分析
紫外可见分光光度计作为化学物质定量分析的常用仪器，广泛应用于科研、生产、国防等各个领域。为了保证仪器测量数值的准确可靠，必须依据JJG178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计》检定规程进行检定。然而在使用和检定过程中，常遇到仪器透射比示值发生偏差或检定结果有所不同，对此，笔者从以下三个方面对产生偏差的原因进行分析。
一、从仪器和样品在光路上分析
分光光度计的基本原理是，溶液中的物质在光的照射激发下，具有选择性吸收现象，可对物质进行定性和定量的分析。它符合朗伯-比耳定律:
式中:T——透射比；I——透射光强度；I0——入射光强度；A——吸光度；K——吸收系数；C——溶液的浓度；L——溶液的光径长度。
而朗伯-比耳定律应用的条件是:一是必须使用单色辐射光；二是吸收发生在均匀的介质；三是吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。在实际工作中，吸光度与浓度之间的线性关系常常发生偏离，其主要因素有以下几点:
1.仪器的非单色光影响
在紫外可见分光光度计中，使用连续光源和单色器分光，得到的不可能是真正的“单色光”。为了保证足够的光强，分光光度计的狭缝必须保持一定的宽度。因此，由出射狭缝照射到被测物质上的光，并不是理论上要求的单色光，而是一个有限宽度的谱带，称为光谱带宽。来自出射狭缝的光，其光谱带宽大于吸收光谱谱带时，照射在样品上的光中就有非吸收光。随着光谱带宽的增大，吸收光谱的分辨力下降，而偏离朗伯-比耳定律。非吸收光愈强，对测定灵敏度的影响就愈严重，并且随着被测样品浓度的增加，非吸收光的影响增大。当吸收很小时，非吸收光的影响可以忽略不计。
2.仪器的非平行光影响
当入射光与吸收池的光学面不垂直时，使通过样品的实际光程大于吸收池的厚度。但这种情况对测量影响很小，一般可忽略不计。而此时未通过样品的光在比色架上或样品室内发生反射、散射现象，也会导致偏离朗伯-比耳定律。
3.样品的散射影响
由于样品的不均匀也会引起对朗伯-比耳定律的偏离。当被测样品中含有悬浮物或胶粒等散射质点时，入射光通过样品就会有一部分光因散射而损失掉，使透射光强度减小，实测吸收光度增大，导致偏离朗伯-比耳定律。
4.样品的荧光影响
某些物质吸收光以后，会辐射出波长与入射光波长不同的荧光，荧光的存在将导致朗伯-比耳定律失效。
5.样品的化学因素
在被测样品溶液中，被测组分发生离解、缔合、光化等作用，或与溶剂相互作用，就会使被测组分的吸收曲线明显改变(如吸收峰的形状、位置、强度以及精细结构都会发生变化)，导致偏离朗伯-比耳定律。
6.仪器的机械因素
仪器生产时比色皿架的安装有微小偏差(不影响正常使用)。仪器比色皿架与比色架底板安装有微小偏移，使光束不能完全透过比色皿射入检测器，而射在比色皿以外部位，造成有效光能的损失，使入射的单色光强度发生变化，从而显示的透射比值偏离了标准值。还有的是仪器光门闭合不良导致漏光，而使透射比值发生偏离。
二、从检定所用的标准器上分析
检定分光光度计透射比值所用的标准物质，有用于检定可见光区的中性滤光片，以及用于检定紫外光区的标准中性滤光片或标准溶液。
1.标准中性滤光片
用于检定可见光区的中性滤光片。每片滤光片的证书都给出了可见光区3个波长(通常为440nm、546nm、635nm)及相应光谱带宽下的透射比，其相对不确定度为0.5%，其透射比名义值为10%、20%、30%等。
用于检定紫外光区的标准中性滤光片，每片滤光片的证书都给出了紫外光区4个波长(通常为235nm、257nm、313nm、350nm)及相应光谱带宽下的透射比，其相对不确定度为0.5%。
滤光片本身的结构原因:以上光谱中性滤光片都是经过长期稳定性考核可作为标准物质使用的，这里要提的是这种标准滤光片其本身结构杂散光、波长误差、样品不均匀等所带来的影响在检定时是不予考虑的，但在引起透射比示值偏差的不确定度分析中是要考虑的因素。另外，标准滤光在加工质量上，因其边缘是由金属外壳包装固定，当外壳出现细微变形(不影响正常检定)，这种情况下的透射比示值就可能脱离实际测量值。同时，当标准滤光片的表面有灰尘或其他脏物时，也直接影响示值准确性，因此在实际工作中对光谱中性滤光片应注意保持清洁。
滤光片的方向性问题:有些滤光片是有方向性的，所以检定时应按标准滤光片上所指示的方向放置于比色架中，否则也可能引起偏差。
2.标准溶液
紫外分光光度标准溶液包括一个空白及一个吸光度(透射比)的标准溶液，GBW(E)130066为K2Cr2O7的溶液。当用液体标准物质作为标准器进行检定时，必须使用标准石英吸收池，其两透光面的垂直距离为(10.00+0.002)mm，且两透光面的平面性和平行性均需严格控制。使用时可用同一吸收池作空白与标准的测量，以便得到溶液的净透射比。如果使用不同的吸收池作空白与标准的测量时，应严格控制吸收池的配套。zui好对配套误差进行修正。标准溶液的温度也会影响透射比示值，标准溶液的证书也给出了不同温度下标准溶液的透射比值。而检测室内环境的温度与标准溶液的温度并不完全一致，这一偏差也影响了透射比示值的测量准确性。
三、从仪器的样品室及人员操作上分析
透射比准确度是指仪器透射比示值与透射比约定真值间的一致程度。透射比重复性是指对仪器透射比示值进行多次测量所得结果之间的一致性。在对透射比示值检定时，除了要按JJG178-2008的要求进行检定外，还应注意:
1.有的仪器未达到一定预热时间，会造成光电系统不稳定，透射比值会发生漂移，所以要按说明书的要求，对仪器进行必要的预热。
2.有些国产设备中上限位器的作用是由底架的弹珠决定的，即使上面的位置对好了，还要注意弹珠的定位手感，这一点十分重要。尤其是在30%挡，最容易拉过一点点，透射比的偏差是很大的，检测时要给予充分考虑。
3.有的仪器由于长时间使用后会使光门组件损坏，使光门的闭合不良，用手轻压盖板，仪器示值会发生明显变化，这会造成透射比值的重复性偏差，此时需对光门组件进行调整方可使用或检定。
4.对于有方向性的标准滤光片，检定应按方向把标准滤光片放置于样品室比色架上。
四、结束语
通过上述对影响分光光度计透射比值偏差的各类原因分析，我们知道透射比示值是分光光度计的一项重要技术指标。我们在检定、检修或使用分光光度计的过程中，当透射比示值发生偏差或超标时，应考虑上述因素的影响，以免作出误判或错误的检测结论。而在对分光光度计透射比偏差的不确定度来源分析中也应视情况考虑上述因素的影响。
