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制滴菌素A对小鼠克隆胚胎的染色体重建

2019.4.20

实验概要

体细胞移植胚胎制备完成后，若用制滴菌素A(TSA)处理一下，其胚胎制备效率会显著增加。本次试验中以小鼠早期SCNT胚胎为研究对象，检测了TSA在体细胞核重编程方面的影响；检测方面包括：染色体重排、组蛋白修饰、DNA复制和转录活性恢复。

实验步骤

1. 卵母细胞收集

B6D2F1雌鼠注射5 IU马绒毛膜促性腺激素，48h后注射5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)。注射hCG 16h后从小鼠输卵管收集卵母细胞。收集到卵母细胞后，在HEPES-CZB中用0.1% hya 脱颗粒细胞获得裸卵。挑选细胞质均匀的卵母细胞转移入含1%BSA的KSOM液中，然后放入37°C培养箱中待用。

2. 精子注射用于核移植

利用胞质内精子注射技术(ICSI)制备受精胚胎。用piezo活化显微操作系统对准精子“颈部”反复吹打，将精子头部与尾部分开。室温条件下，将精子头部注入卵母细胞内。使重构胚恢复10-20min，然后将其移入KSOM液中，在37°C培养箱中培养待用。

3. 制备卵丘细胞为供体细胞的核移植胚胎(NT)

制备好的胚胎在含50nM TSA的激活液中培养6h以抑制HDAC。后将胚胎转入含50nM TSA的KSOM中培养4h。最后将培养移入纯培养液中培养。

4. DNA合成的检测

通过掺入的5-BrdU(脱氧尿苷)检测DNA的合成。胚胎在10μM BrdU中孵育30min。胚胎用4%多聚甲醛中固定，然后利用间接免疫荧光显微镜检查观察DNA中掺入的BrdU量。

5. 在胚胎中掺入BrUTP并检测新的转录物

胚胎在电透化液(含0.25M葡萄糖，100 μM CaCl₂.2H₂O，100 μM MgSO₄ and 0.1% PVP)中洗两次，然后移入转录液(电透化液 10mM BrUTP,BrUTP：5-溴尿核苷 5’-三磷酸根)中。然后将胚胎转入覆盖有20μL转录液的电促细胞融合仪的两电极中间；采用250V/cm，80 μs，2次的参数，对胚胎进行透化，(每次透化间隔为2min)。胚胎透化后2min移入CZB中培养1h然后再移入上述转录液中。最后胚胎用4%多聚甲醛中固定，用间接免疫荧光观察转录物种掺入的BrUTP的含量。在阴性对照组的EP液、转录液、KSOM液中加入5 μg/mL 鹅膏菌素(RNA聚合酶 II和III的抑制剂)。

6. 免疫荧光显微镜检查

本次试验中使用的抗体是兔抗组蛋白H3 丝氨酸10磷酸的多克隆抗体(1:100稀释)，兔抗组蛋白H3丝氨酸28磷酸的多克隆抗体(1:100稀释)，兔抗组蛋白H3赖氨酸4乙酰基多克隆抗体(1:100稀释)，兔抗组蛋白H3赖氨酸4二甲基多克隆抗体(1:100稀释)和鼠抗BrdU单克隆抗体(6μg/mL)。用鼠抗Lamin B单克隆抗体标记细胞膜。二抗为Alexa-Fluor-568 标记的山羊抗鼠 IgG抗体或Alexa-Fluor-488 标记的鸡抗兔 IgG抗体(1:200稀释)。用2 μg/mL4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Molecular Probes)标记DNA。

为了检测DNA合成，在胚胎进行一抗孵育前，固定后的胚胎用2N HCL室温处理1h，后用100mM Tris/HCL(pH 8.0)中和20min，之后用含1%BSA的磷酸盐缓冲液洗净。然后再按照上述步骤进行免疫荧光的检测等。

7. 细胞核中荧光强度的定量检测

对胚胎进行Confocal检测，细胞核中的荧光强度用相关软件进行定量分析。核中荧光强度通过手动描绘显示器上细胞核的轮廓来计算。细胞核随机选择，每枚细胞核的荧光强度通过五个不同区域计算后平均所得，并且细胞质的荧光强度影响已经被减去了。用计算出的荧光强度与核体积相乘得出相对值进而计算核总荧光强度。为了计算核体积的变化，任意的将SCNT胚胎用TSA处理过后6h是的核体积定义为100%。每个试验组在不同时间的核体积根据此时间的核体积进行相对值计算。为了定量化BrUTP，将每次试验中受精胚胎中BrUTP的最大值定义为100%，其他试验组的荧光强度根据此强度进行相对计算。我们根据荧光强度将新生成的RNA分为三个层次，高(>60%)中(20–60%)低(<20%)。

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