使用Viscotek TDAmax多检测器凝胶渗透色谱检测分离乳清蛋...
使用Viscotek TDAmax多检测器凝胶渗透色谱检测分离乳清蛋白（WPI）
概述
乳清（Whey）是在奶酪生产过程中，牛奶凝结成凝乳块后分离出的呈绿色的、半透明的液体，是生产过程中的一个副产品。分离乳清蛋白（Whey Protein Isolate，简称WPI）是从中提取的一种膳食补充剂。分离乳清蛋白可以做到纯度很高，几乎无糖，无脂肪。分离乳清蛋白在整个牛奶中的含量仅为0.7%左右，弥足珍贵。
分离乳清蛋白具有很高的营养价值，已成为各种保健食品中的重要功能成分。WPI广泛用于婴儿配方,是婴儿生长发育过程中最佳的天然氨基酸来源，也广泛作为乳化剂和稳定剂应用在食品工业。WPI由于其能迅速被吸收消化，帮助改善运动后身体的代谢状态，也深受运动员和健身爱好者喜爱。它已被报道，WPI可能过程抗炎和抗癌特性。
WPI由四个主要部分组成：β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin）、血清白蛋白（serum albumin）和免疫球蛋白（Immunoglobulins）。
β-乳球蛋白是WPI的主要成分，存在于许多其他哺乳动物物种的乳汁中。然而，不存在于人类母乳。约85%对牛奶过敏的儿童在他们三岁后不再过敏，但仍有15%过敏。β-乳球蛋白是牛奶中的主要过敏原，所以乳制品生产商需要标注β-乳球蛋白存在与否，以确保满足不同消费者的需要。β-乳球蛋白是由162个氨基酸组成的蛋白，分子量为18.4kDa，在生理条件下以二聚体形式存在。
α-乳白蛋白存在于几乎所有的哺乳动物物种的乳汁中，参与到乳糖的合成代谢，分子量为14178 kDa。
血清白蛋白是由肝脏产生的，其功能主要是作为血液中的一种载体蛋白，运输类固醇，脂肪酸和甲状腺激素，它在通过贡献胶体渗透压来稳定细胞外液容量中，起着重要的作用。血清白蛋是水溶性的球状蛋白，分子量约为65kDa。
免疫球蛋白（Ig），也被称为抗体，免疫系统通过其识别和中和外来物，如细菌和病毒。在胎盘类哺乳动物中有五种抗体同种型，分别称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。免疫球蛋白分子量约为150kDa。
材料与方法
使用马尔文公司的Viscotek TDAmax多检测器凝胶渗透色谱系统进行分析测试：示差折光检测器（RI）、紫外检测器（UV）、7°角光散射（LALS）、90°角光散射（RALS）和粘度（IV）探测器。
● 色谱柱为Viscotek p-columns系列，1 * P4000和1 * P3000。
● 流动相为0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液，进样量约为500μg。
● 使用Omnisec软件进行数据分析处理。
结果与讨论
1) 组分解析
X轴为保留体积，Y轴分别为示差RI检测器、紫外UV检测器、直角光散射RALS检测器、小角光散射LALS检测器和粘度DP检测器。
免疫球蛋白 | 血清白蛋白 | β-乳球蛋白 | α-乳白蛋白 | |
峰值保留体积-(ml) | 17.057 | 18.174 | 19.238 | 20.349 |
数均分子量（Da） | 150,329 | 70,310 | 30,745 | 15,410 |
重均分子量（Da） | 151,366 | 70,469 | 31,847 | 15,549 |
Z均分子量（Da） | 152,485 | 70,635 | 33,125 | 15,697 |
峰值分子量（Da） | 127,955 | 69,619 | 30,683 | 15,800 |
多分散度Mw / Mn | 1.007 | 1.002 | 1.036 | 1.009 |
特性粘度（dL/g） | 0.0596 | 0.0506 | 0.0339 | 0.0289 |
流体力学半径（nm） | 5.181 | 3.833 | 2.564 | 1.921 |
组分含量（%） | 0.024 | 0.064 | 0.737 | 0.175 |
所有样品的dn/dc均设为0.185。
峰3的组分显示分子量为33kDa左右，在组分中的质量百分含量为75%左右，这个组分应为β-乳球蛋白，其在活性状态为二聚体，且是WPI中的主要组分。
峰4的组分为α-乳白蛋白，分子量15kDa，与理论值相符。一个有趣的发现是，α-乳白蛋白示差峰的响应不到β-乳球蛋白的一半，α-乳白蛋白的紫外信号响应很接近β-乳球蛋白，这表明α-乳白蛋白在280nm处比β-乳球蛋白具有更高的紫外消光系数。
峰1和峰2的分子量分别为150K和70K，根据分子量得知峰1为免疫球蛋白，峰2为血清白蛋白。
所有四个峰的多分散性PD值都小于1.04，这是预期相符，事实上，所有蛋白质都是单分布的。
凝胶色谱的分离机制是体积大的组分先流出，体积小的后流出，流体力学半径Rh与分子量的结果，确认较低的分子量蛋白质有较小的尺寸。特性粘度也随着分子量的减小而降低，但不是线性关系，表明不同蛋白结构间的差异。β-乳球蛋白最好的解释了这种现象，β-乳球蛋白的分子量是α-乳白蛋白的两倍左右，特性粘度只高出15%左右，这说明二聚体的β-乳球蛋白比单聚体的α-乳白蛋白结构更加紧凑。
2) 聚集体检测
在10-12ml低保留体积，RALS与LALS都出峰，而RI或UV未出峰，RI和UV信号正比于浓度，所以组分浓度很低；LS是分子量与浓度乘以分子量成正比，所以分子量只有很大才能生成光散射峰。另一个聚集峰的特征是，低保留体积，说明其尺寸大。粘度检测器也未出峰，说明聚集体非常紧凑，因此特性粘度低。
结论
本应用报告的数据表明，马尔文Viscotek TDAmax多检测器凝胶渗透色谱系统可用来分离复杂的蛋白质混合物，如WPI。在本篇报告里，通过一个测试得到WPI的四个组成部分：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的分子量、组分含量、流体力学半径以及结构相关的信息。并且，通过光散射检测到了浓度低、不易被RI示差检测到的聚集体。Viscotek TDAmax的此类应用使其成为食品与营养应用研究、以及生物制药领域中蛋白研究的的理想方法。
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技术原理
