外泌体中评估mTBI患者神经退行性病变和细胞毒性标志物
创伤性脑损伤（TBI）是全球性的公共卫生问题。由于缺乏良好的诊断工具和干预手段，TBI患者数量被严重低估，尤其是在体育运动员和军人群体中。目前TBI的诊断方式只有昂贵的神经影像技术和脑脊液（CSF）检测。轻度创伤性脑损伤（mTBI）更是难以诊断，目前还没有一种可以基于血液诊断的生物标志物。因此迫切需要血液中生物标志物的开发，以便在更早和更可治疗的时间点确定大脑的症状和神经病理学变化。
美国加利福尼亚大学科研人员的早期工作证明了血浆神经源性外泌体（NDE）作为生物标志物可用于阿尔兹海默症（AD）和其他疾病的神经退化检测，然而其作为轻度创伤性脑损伤（mTBI）的诊断标志物的研究还很有限。所以该课题组选取了NDE和星形细胞源性外泌体（ADE）蛋白作为潜在的生物标志物来进行研究。本研究发现mTBI患者的NDE蛋白对体外培养的神经元样受体细胞具有毒性，而ADE蛋白则没有。mTBI患者的NDEs中存在神经退行性变的标志物，并提示这些NDEs可作为鉴别TBI发病机制的工具。这一研究成果于2019年10月发表于Frontiers in Neuroscience（IF=3.6）上。
Assessing Neuronal and Astrocyte Derived Exosomes From Individuals With Mild Traumatic Brain Injury for Markers of Neurodegeneration and Cytotoxic Activity
研究对象
所有研究对象均为男性现役军人，平均年龄21.87岁（SD=2.76），详见表一。
研究结果
1.人血浆中的NDEs和ADEs蛋白的富集和分选
首先，研究人员使用结合有外泌体抗体和FITC复合物的磁珠来免疫富集人血浆中的NDEs和ADEs（图1A）。使用CD171（神经细胞粘附分子配体1）来特异性免疫捕获NDEs；GLAST（谷氨酸/天冬氨酸转运体）用来免疫捕获ADEs。富集后的复合物使用流式细胞仪根据绿色荧光强度进行分类。阳性对照为磁珠-抗体-外泌体-FITC复合物，阴性对照则为不含外泌体的磁珠-抗体-FITC复合物（图1B）。由流式结果可知，实验组和对照组在FITC+的数量上没有明显差异（图1C）。针对外泌体标志物CD81的ELISA实验也显示，实验组和对照组之间没有明显差异（图1D）。
图1
2.与对照组相比，mTBI患者血浆的NDEs和ADEs中Aβ42浓度水平较高，而NRGN的浓度水平较低
ELISA结果显示，与对照组血浆样本相比，mTBI组血浆样本中Aβ42的水平在NDEs和ADEs中都显著升高（图2A），NRGN水平（图2B）则显著降低。两组的P-T181-tau水平在NDEs和ADEs中均无显著差异（图2C）。两组的P-S396-tau水平在NDEs中无显著差异；而在ADEs中，与对照组相比，mTBI组P-S396-tau的水平升高，但无显著性差异（图2D）。在两种来源的外泌体中，与NDEs相比，ADEs的Aβ42（ADE组：1.18 pg/mL；NDE组：0.29 pg/mL）和P-396-tau（ADE组：16.26 pg/mL；NDE组：5.47pg/mL）水平更高，但具体机制还不清楚。
图2
用超灵敏单分子免疫阵列分析平台（Simoa平台）对血浆外泌体的蛋白定量显示，在NDE组中，mTBI与对照的Aβ40（图3A）、NFL（图3B）和T-tau（图3C）的浓度水平没有显著差异，而在ADE组中，mTBI与对照的Aβ40、T-tau和NFL的浓度水平在Simoa平台上非常低，接近检测不到。
图3
本研究首次报道了在血浆NDE和ADE蛋白中，Aβ42和NRGN的浓度水平可以区分mTBI患者（见ROC分析，表3）。
3.实验组的血浆NDE外泌体蛋白在体外对受者细胞具有毒性
研究人员还在体外测试了血浆NDE和ADE蛋白在神经元样细胞中的致病潜能。已有研究表明，NDEs可以在体内传播毒性蛋白，并在体外对受体细胞产生毒性。该研究首先用NDE或ADE蛋白处理PC12细胞（PC12细胞中已预先加入NGF，即神经生长因子进行诱导分化），再通过测定乳酸脱氢酶（LDH）在细胞培养基中的释放量来评价外泌体诱导的细胞毒性。结果显示经mTBI患者血浆NDEs处理过的细胞显示出明显的细胞毒性迹象，显微照片清楚展示了树突气泡、抑制神经突起生长和细胞死亡等迹象（图4A）。与对照组（100%存活率）相比，被mTBI患者的NDE蛋白处理过的细胞，经外泌体诱导后细胞毒性增加约三倍（286.7%）（图4B，P<0.05）。同样的，将不同分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞用NDE或ADE蛋白处理，同时用已确诊的AD患者的血浆NDE蛋白作为阳性对照。可观察到经由外泌体诱导的细胞毒性增加了大约三倍（265.8%），（图4C，P＜0.05）。有趣的是，ADEs并没有诱导细胞毒性或损害神经生长因子诱导的PC12细胞或SH-SY5Y细胞（图4C）的膜完整性。
图4
本研究发现血浆NDEs对受体细胞具有毒性，并首次报道血浆ADEs对神经元样细胞无毒。血浆NDEs和AEDs中都含有可检测的Aβ42和P-tau蛋白，但只有mTBI患者血浆中的NDE蛋白对体外培养的神经元样细胞有毒性。一种解释是神经元样细胞不容易接受ADEs。另外一种解释是，与血浆NDE组相比，血浆ADE组中Aβ42和P-tau浓度的降低不足以诱导产生细胞毒性。
小结
本文在血浆外泌体中蛋白质含量的变化，而先前的研究报道则在血清和/或脑脊液中进行。已知外泌体在细胞间穿梭并运输蛋白质和miRNA等物质，有助于清除多余或受损的细胞内蛋白质及其细胞内溶物。然而目前在中枢神经系统中，外泌体转运和功能背后的基本机制仍然未知，为了提高外泌体在治疗和诊断中的临床应用价值，我们必须更深入地了解这些细胞过程。
将外泌体转运的蛋白作为潜在的生物标志物，在未来可能会产生重要的临床应用。目前正在进行确定这些蛋白质在脑损伤后时间进程的研究，并需要阐明这些蛋白质是否可预测长期慢性和/或其他疾病。此外，本研究的研究对象是一个男性军人群体，在正常人和女性mTBI群体中的适用性还需进一步探索和研究。
在过去的2019年，也是外泌体研究热度持续升温的一年，无论是其功能研究还是如何将其用于微创诊断的开发都有重大的研究进展。蛋白作为最终表达产物，外泌体蛋白研究领域也必将成为外泌体研究不可或缺的部分，Simoa是目前最灵敏的蛋白质检测技术，飞克级别的检测灵敏度可以弥补传统Western Blot，ELISA等方法的不足，将极大推动外泌体中蛋白成分的研究。SBC目前具有成熟和完备的外泌体分离，鉴定以及Simoa蛋白质检测平台，欢迎实验咨询。
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技术原理
