肿瘤细胞体外传代培养及保种
肿瘤细胞体外传代培养及保种可应用于：（1）研究癌变机理；（2）抗癌药检测；（3）癌分子生物学研究。
| 实验方法原理 | 肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，是比较容易培养的细胞。癌细胞形态不规则，细胞界限清晰，对营养要求不高，在体外培养可无限制传代而不凋亡。体外培养的细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列细胞生物学特性鉴定。 肿瘤细胞可置于低温下保存。-80℃下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5—10 年, 甚至更长的时间。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、细胞复苏与培养
将液氮或-80℃保存的肿瘤细胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500 转/分, 离心3 分钟。弃上清, 再吸取8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀, 再1500 转/分, 离心3 分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml 培养基混匀, 备用。另取一个75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育箱中培养。若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约3－4 天细胞基质会变黄, 5.0ml 细胞悬液可传代一个方瓶培养, 可用3－4 个方瓶培养, 一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1-1.5x107 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数。若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过3-4 天, 肿瘤细胞生长至80%-95% 单层时, 弃上清, 用0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约3-5 分钟, 用倒置显微镜观察，当90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml 离心管中, 于1500 转/分下，离心3 分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代3 个 75cm2方瓶扩大培养。
二、细胞冻存
将对数生长的肿瘤细胞用1 个75cm2方瓶按上述方法收集, 于1500 转/分离心3 分钟,弃上清, 用保种液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混匀, 分别加入到2-3 只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80℃保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80℃下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5-10 年, 甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌( 121℃, 30 分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。 展开 |
| 注意事项 | 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。 |
| 其他 | 1.癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，应当在传代时采用消化消除法及反复贴壁法加以清除。 2.在早期传代时要适当提高接种浓度。 3.对于增殖能力极低的细胞，应放入饲养层培养，并加入一些促生长物质，如胰岛素，雌激素，EGF，氢化考的松，软铁蛋白等因子。 |
